《Archives of Virology》：Detection, genetic characterization and reassortment analysis of Tribe? virus
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本研究針對蜱傳環狀病毒（Orbivirus）中的Tribe?病毒（TRBV）遺傳多樣性與進化機制開展調查。研究人員通過新設計的RT-PCR方法在斯洛伐克地區山羊攜帶的篦子硬蜱（Ixodes ricinus）中檢測并分離到一株新病毒株，利用免疫熒光、病毒復制動力學及全基因組測序等技術進行鑒定和系統發育分析。研究首次發現該毒株存在基因組重配（reassortment）事件，其編碼NS1蛋白的第4基因組片段可能源自1960年代的原型毒株。這一結果為理解蜱傳環狀病毒的傳播、生態學及潛在的致病機制提供了重要依據，并強調了對神經系統感染進行更廣泛鑒別診斷的必要性。
在歐洲和亞洲的森林與草地中，篦子硬蜱（Ixodes ricinus）等蜱類不僅是蜱傳腦炎病毒（TBEV）的傳播者，還攜帶著一群不那么引人注目但同樣具有潛在威脅的病原體——蜱傳環狀病毒（tick-borne orbiviruses）。其中，Tribe?病毒（TRBV）、Kemerovo病毒（KEMV）、Lipovník病毒（LIPV）和日本的Muko病毒（MUKV）都屬于大島病毒（Great Island virus, GIV）血清群。這些病毒與TBEV共享相似的生態位和傳播循環。已有報告將KEMV、LIPV和TRBV的感染與不明病因的神經系統疾病病例聯系起來，感染癥狀可能與蜱傳腦炎相似。然而，由于缺乏特異性的臨床癥狀，加之診斷上的挑戰，這些病毒在中樞神經系統（CNS）感染的鑒別診斷中常常被忽視。例如，在斯洛伐克，2016年至2018年間，有40%的病毒性中樞神經系統感染被診斷為“非特異性病毒性腦炎、腦膜炎或病毒性中樞神經系統感染”，這凸顯了對這些“被遺忘”的病毒加強監測和理解其進化動力學的迫切需求。為了更深入地了解TRBV的遺傳多樣性、潛在的進化機制及其在自然界中的循環，研究人員在斯洛伐克開展了一項研究。
本研究主要應用了以下幾個關鍵技術方法：首先，研究人員從斯洛伐克杜布拉瓦地區放牧的山羊身上收集了篦子硬蜱，并采集了山羊血清樣本。其次，研究團隊為新檢測目的設計了一對特異性引物，采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）對蜱樣本進行病毒篩查。第三，利用Vero E6細胞對RT-PCR陽性的蜱懸液進行病毒分離，并通過免疫熒光技術（immunofluorescence）和中和試驗（neutralization test）分別進行病毒抗原鑒定和山羊血清抗體檢測。第四，研究了新分離毒株在嚙齒動物（BHK-21）、人（HFF-1）和牛（BT）細胞系中的復制動力學。最后，通過下一代測序（next-generation sequencing）獲取了病毒的全基因組序列，并利用系統發育分析（phylogenetic analysis）和重組檢測程序（Recombination Detection Program 4， RDP4）等生物信息學工具進行遺傳特征和重配分析。
Detection and isolation of TRBV in ticks（TRBV的檢測與分離）
研究團隊新設計了一對針對GIV血清群病毒第1基因組片段的引物，其RT-PCR檢測限為103PFU/ml。從一只飽血雌性篦子硬蜱的勻漿中檢測到病毒RNA，并通過測序證實其為TRBV。將該勻漿接種Vero E6細胞后，成功分離到一株新的TRBV毒株，命名為16.C/2016/Dubrava/SVK。
Prevalence of TRBV neutralization antibodies in grazing goats（放牧山羊中TRBV中和抗體的流行率）
對同一地區放牧山羊的血清學監測顯示，所有動物在研究期間均保持臨床健康。2016年未檢測到中和抗體，2017年9只山羊中有5只（55.6%）出現低滴度（1:10至1:20）的血清陽轉，表明它們在該地區感染了TRBV或相關病毒。
The replication of TRBV isolate in rodent, human and bovine cell lines（TRBV分離株在嚙齒類、人和牛細胞系中的復制）
病毒復制動力學研究表明，新毒株在三種細胞系中均能復制并引起細胞病變效應（CPE），但效率不同。在嚙齒類BHK-21細胞中復制效率最高，病毒滴度持續上升至72小時，達到5.75 × 105PFU/ml。而在人源HFF-1和牛源BT細胞中，病毒復制受到一定限制，峰值滴度分別為6.83 × 103PFU/ml和5.00 × 104PFU/ml，這可能與這些細胞完整的I型干擾素應答有關。
Genetic and phylogenetic analysis（遺傳與系統發育分析）
對新毒株進行全基因組測序和比對分析發現，其大多數基因組片段與其他TRBV毒株以及日本的MUKV毒株具有較高的序列一致性。然而，編碼外衣殼蛋白VP4（OC1）的第5片段是一個例外，它與俄羅斯的KEMV毒株在序列一致性和系統發育關系上更為接近。此外，編碼NS3糖蛋白的第10片段顯示出最高的遺傳變異性：斯洛伐克和羅馬尼亞的TRBV毒株與MUKV聚為一支，而烏克蘭的TRBV毒株則與KEMV形成姊妹支。
Reassortment analysis（重配分析）
利用RDP4軟件對串聯的TRBV基因組序列進行分析，預測到一個重配事件。該事件得到六種檢測方法的支持，預測的重組斷點位于串聯序列的第8191和10049位點，對應于第4基因組片段。SimPlot分析進一步支持了這一發現。這表明新分離株16.C/2016/Dubrava/SVK的第4片段（編碼NS1蛋白）可能源自20世紀60年代在斯洛伐克分離的原型TRBV毒株。
本研究總結與討論部分強調了蜱傳環狀病毒在診斷和公共衛生方面的重要性。研究成功從斯洛伐克地區的蜱體內分離并鑒定了新的TRBV毒株，證實了該病毒在當地自然疫源地中的持續循環。血清學證據表明，放牧山羊可以成為監測蜱傳病毒暴露的有用哨兵動物。
遺傳分析揭示了TRBV復雜的進化圖景。雖然TRBV、MUKV、LIPV和KEMV目前被歸類為同一病毒物種（GIV）的不同血清型，但本研究和先前工作表明，它們在關鍵的RdRp和T2蛋白上的序列一致性低于物種劃分的典型閾值，提示它們可能代表地理分布廣泛的、不同的環狀病毒譜系。特別值得關注的是，新毒株的外衣殼蛋白VP4（OC1）在系統發育上與KEMV聚在一起，而其他內部蛋白則與TRBV/MUKV分支更近，這種“鑲嵌式”的基因組構成是病毒進化中重配事件的典型特征。研究明確鑒定出新毒株的第4片段（編碼NS1蛋白）可能源自歷史毒株，這是首次在TRBV中報道自然發生的重配事件。NS1蛋白是病毒蛋白合成的正調節因子，其重配可能影響病毒在宿主或媒介中的適應性和復制效率，這在對藍舌病病毒（bluetongue virus, BTV）的研究中已有先例。
此外，研究觀察到第10片段（編碼NS3/NS5蛋白）的高變異性，這可能影響病毒在細胞內的運輸和釋放機制，進而影響其在不同媒介或宿主中的傳播效率。
在討論中，作者指出，盡管蜱傳環狀病毒在IFN-Ⅰ型反應完備的細胞中復制受限，但它們仍能成功復制，提示其可能存在如NS4蛋白介導的免疫逃逸機制，這一點值得未來研究。最后，作者呼吁有必要開展進一步研究，以闡明這些病毒的生態學、宿主免疫反應及其抗病毒逃避機制，特別是考慮到它們與不明病因的神經系統疾病的潛在關聯，以及在全球氣候變化和人類活動影響下蜱媒疾病負擔可能增加的趨勢。
本研究發表在《Archives of Virology》上，為理解蜱傳環狀病毒的遺傳多樣性、進化動力學及其在自然界的維持機制提供了新的重要數據，強調了在病毒性中樞神經系統感染鑒別診斷中考慮這些病原體的必要性，并為未來的監測和防控策略提供了科學依據。
