白色念珠菌(Candida albicans)是一種常見于人體消化道、泌尿系統等生態位點的致病真菌，通常在免疫系統減弱或黏膜受損時引發感染。其致病性與形態轉換密切相關，能夠在酵母、假菌絲和真菌絲形態間切換。其中，菌絲形態在組織穿透、免疫逃逸和加劇系統性感染中起關鍵作用。然而，直接干預三種形態間轉換的藥物靶點尚未明確，驅動形態轉換的確切機制也未完全解析。本研究聚焦于乙醇脫氫酶I(Adh1)，該酶不僅參與糖酵解等基礎代謝，此前也被發現與真菌毒力增強、耐藥性形成和免疫逃逸過程密切相關。研究旨在闡明Adh1在白色念珠菌多態性轉換中的具體功能和機制，并嘗試從天然產物中篩選靶向Adh1、影響多態性的先導分子。

生物膜為白色念珠菌提供了穩定的保護性生態，是復發性念珠菌感染的主要原因。成熟的生物膜構建包括黏附、萌芽、成熟和分散四個階段，其中菌絲形成是侵襲性感染的核心環節。通過同源重組策略構建^ADH1敲除株和^ADH1基因過表達株后發現，高水平的Adh1抑制了菌絲在Spider培養基表面的延伸或向培養基內部的擴展。相反，^ADH1的缺失促使真菌分化為真菌絲并更深入地侵入瓊脂。與此表型一致，白色念珠菌菌絲相關基因（包括^ECE1、^HWP1、^BCR1和^TEC1）的mRNA水平也隨Adh1表達量的改變而變化。因此，白色念珠菌Adh1是真菌絲形成的有效抑制因子，賦予了菌株在生物膜誘導條件下充足的多態性靈活性。

基于野生型和^ADH1敲除白色念珠菌成熟生物膜的定量分析，研究篩選了一個涵蓋多種類型化合物的天然產物庫。考慮到藥物作用的靶點依賴性，當蛋白質靶點缺失時，化合物的藥效預期會發生改變。因此，監測天然產物在^ADH1缺失前后對生物膜抑制率的變化是鑒定Adh1功能調節劑的關鍵策略。對114種天然產物的初篩鑒定出15個優先抑制野生型而非^ADH1-KO生物膜的候選物。其中，蒽醌類是最富集的類別。檢測結果表明，蒽醌類化合物如1,4-萘醌、2-甲基蒽醌、蘆薈大黃素和2-羥基蒽醌(HAQ)在^ADH1缺失后顯示出生物膜抑制作用的顯著降低。其中，HAQ和1,4-萘醌表現出最優異的活性，在40 μg/mL濃度下分別將總生物膜生物量下調97.3%和71.8%。值得注意的是，高濃度的HAQ未對白色念珠菌生長表現出顯著抑制，這與^ADH1不參與菌株生長動力學調控的事實相符。最終，研究檢測了HAQ發揮生物膜抑制作用的Adh1依賴性。與對照組相比，敲除^ADH1削弱了HAQ對成熟生物膜形成的限制作用，此時HAQ無法阻止生物膜內菌絲發育為真菌絲。相反，過表達^ADH1是HAQ抑制活性的有效貢獻因素，表明Adh1是HAQ的藥理學靶點。綜上所述，HAQ通過Adh1抑制白色念珠菌生物膜內的菌絲發育。

本研究通過將白色念珠菌的全蛋白溶液流經固定了蒽醌化合物大黃素的環氧活化層析柱，捕獲能與蒽醌類相互作用的蛋白，隨后用HAQ溶液競爭性洗脫HAQ特異性結合蛋白。在質譜鑒定結果中，根據MaxQuant評分大于50作為合理性標準，豐度最高的三種蛋白是轉錄因子Tup1、烯醇化酶Eno1和乙醇脫氫酶Adh1。這些結果表明上述三種蛋白都可能與HAQ相互作用。由于質譜無法表征直接的化合物-蛋白質結合，研究隨后進行了分子對接模擬和體外實驗驗證。分子對接預測結果顯示，Tup1和Adh1能夠以穩定的構象與HAQ結合，結合能分別為-8.5 Kcal/mol和-8.0 Kcal/mol。考慮到Adh1也是本研究的焦點和HAQ的功能靶點，Adh1被初步鑒定為HAQ抑制生物膜的細胞內靶點。

通過異源表達獲得重組Adh1后，在體外驗證了HAQ與Adh1的相互作用。在差示掃描熒光法中，HAQ的存在導致Adh1在溫度梯度場中僅顯示一個熔解溫度，且Tm值隨藥物濃度增加而升高。同樣，在色氨酸熒光光譜實驗中，隨著體系中HAQ濃度的升高，色氨酸發射熒光的波長逐漸紅移。上述結果表明，與HAQ共孵育不僅增強了Adh1中色氨酸周圍環境的極性，還提高了Adh1的熱穩定性，二者之間存在直接相互作用。隨后通過微量熱泳動評估二者親和力，擬合得到親和力大小為111.86 μM。最后，基于核糖體A位點抑制劑茴香霉素阻斷白色念珠菌內蛋白質翻譯，發現在菌絲誘導環境下，細胞內Adh1水平會隨時間推移而降低。相比之下，在相同條件下，真菌培養物與HAQ共孵育可防止通常在菌絲誘導環境中發生的Adh1降解，使蛋白質水平保持穩定。這一結果意味著進入白色念珠菌的HAQ會直接與Adh1相互作用并增強其穩定性。綜上所述，白色念珠菌Adh1是HAQ的直接靶點。

為深入分析化合物-蛋白質相互作用，通過分子對接模擬了HAQ與Adh1的直接結合構象。結果顯示，Adh1中共有11個氨基酸可能與HAQ結合。其中，化合物通過羰基和羥基與G180、S179和Q257形成共價氫鍵，并通過增稠的三取代苯環分別與F224和A254形成π-π共軛和σ-π超共軛。接下來，選取前10個對接構象并統計11個相互作用氨基酸的出現頻率，F224和A254出現頻率最高，其次是S179、Q257、G180、S249。為驗證上述位點，以F224和A254為分割點，構建了一系列^ADH1異源表達載體，獲得在潛在HAQ結合氨基酸位點發生突變的Adh1。在此基礎上，使用微量熱泳動檢測了HAQ與Adh1突變體的相互作用。結果顯示，F224A導致Adh1與HAQ的結合無法檢測到。與野生型Adh1相比，A254T和Q257A導致Adh1對HAQ的親和力顯著下降，親和常數分別為528.48和4990 μM。相比之下，其余突變形式僅表現出相對溫和的影響。上述結果表明，Adh1的F224、A254和Q257對于HAQ與Adh1的結合至關重要。

為分析Adh1調控白色念珠菌形態轉換的下游信號網絡，本研究利用親和純化-質譜聯用技術，系統比較了HAQ和DMSO處理條件下Adh1相互作用的蛋白質組差異。通過整合生物信息學分析和文獻挖掘，發現Adh1特異性共富集了真菌碳代謝核心調節因子SNF1激酶以及調控SNF1去磷酸化的關鍵復合體組分，而HAQ顯著降低了這些調節元件與Adh1相互作用的強度。這暗示Adh1可能通過與真菌生物膜形成相關的SNF1信號通路來阻斷真菌絲發育，而HAQ則通過靶向破壞Adh1-SNF1復合物的穩定性來調節SNF1信號通路的激活。

為闡明Adh1對SNF1磷酸化的調節作用，通過過表達和敲除^ADH1進行了系統的功能驗證。結果顯示，在生物膜誘導條件下，^ADH1敲除菌株的SNF1磷酸化水平與野生型和過表達菌株相比顯著升高，證實Adh1是SNF1活性的負調節因子。為闡明分子相互作用網絡，本研究在釀酒酵母BJ5464-NpgA中構建了His-Adh1和Flag-Bmh1/Flag-Ssb1共表達系統，發現HAQ特異性地削弱了Adh1與SNF1去磷酸化調節元件（包括Bmh1和Ssb1）的結合強度。值得注意的是，HAQ以劑量依賴的方式顯著降低了SNF1磷酸化水平，且這種效應在^ADH1缺陷菌株中顯著減弱，表明Adh1是藥物作用不可或缺的靶分子。總之，HAQ通過競爭性抑制Adh1與SNF1磷酸酶調節復合物的結合，以Adh1依賴的方式阻斷了SNF1信號通路的激活，從而精確調控真菌形態轉換過程。

Sak1是白色念珠菌中唯一的專一性SNF1激活激酶。為考察SNF1磷酸化對實驗菌株CBS562菌絲形態發生的調節作用，研究敲除了^SAK1。檢測發現，^SAK1敲除菌株維持了極低的磷酸化水平。在Spider固體培養基和RPMI-1640（含10% FBS）液體培養基中，SNF1磷酸化缺陷的機體無法形成用于滲透延伸和三維空間結構組織的菌絲。此時，生物膜僅由酵母型細胞簡單串聯堆疊而成。與表型一致，^SAK1敲除后菌絲相關基因的表達也顯著下降，表明當細胞內SNF1處于低水平磷酸化狀態時，菌株無法進展為菌絲形態，從而穩定保持在酵母形態。在結晶紫染色定量結果中，雖然^SAK1敲除未顯著影響成熟生物膜的生物量，但HAQ的生物膜抑制效應隨之降低。同時，HAQ無法對受阻的酵母或假菌絲形態進行大幅度的形態學調整，這表明HAQ可能借助SNF1信號通路來限制菌絲形成，從而發揮生物膜抑制作用。

接下來，為探究SNF1信號通路與HAQ或Adh1在表型調節中的關系，使用激活劑上調SNF1磷酸化水平，以進一步確認HAQ或Adh1依賴SNF1發揮生物學效應。結果顯示，以劑量依賴方式促進SNF1磷酸化的Dorsomorphin，顯著下調了白色念珠菌成熟生物膜的生物量，并在^ADH1敲除菌株中表現出增強的效力。考慮到預實驗中^ADH1敲除會在生物膜誘導條件下刺激SNF1激活，推測SNF1磷酸化高水平的疊加可能會限制菌株在生物膜構建周期中的形態可塑性。這些發現表明，升高的SNF1磷酸化在誘導白色念珠菌菌絲過度延伸的同時，損害了其形成分支菌絲和進行形態轉換的能力，而這些能力是生物膜組裝所必需的。因此，盡管SNF1磷酸化促進了菌絲延伸，但它同時抑制了生物膜形成。此外，Dorsomorphin促進野生型和^ADH1過表達白色念珠菌發育為真菌絲，且形態趨于一致。因此提示，與野生型菌株生物膜內的假菌絲相比，由^ADH1敲除或激活劑刺激介導的高水平SNF1磷酸化將促進菌株向真菌絲發育。當SNF1磷酸化水平維持在恒定狀態時，Adh1無法在此基礎上對菌絲形態做出某些調整，這表明Adh1是通過調節SNF1磷酸化來發揮表型調節效應的。由于^ADH1敲除菌株的生物膜生物量在高濃度Dorsomorphin中過低，表征其菌絲形態不可行。最后，在生物膜誘導條件下，用Dorsomorphin和HAQ共同處理菌株。結果顯示，兩種藥物協同抑制生物膜形成。在這種情況下，共處理組的真菌表現出真菌絲形態。也就是說，當體系中存在Dorsomorphin時，HAQ無法發揮顯著的菌絲形成抑制作用。上述結果表明，HAQ通過促進SNF1去磷酸化從而下調SNF1磷酸化水平，將白色念珠菌阻滯在酵母形態。總之，HAQ通過Adh1-SNF1信號通路緩解白色念珠菌的絲狀化。

表型可塑性是白色念珠菌最典型的致病特征，由不同形態細胞和胞外基質組成的生物膜是臨床耐藥性念珠菌病的主要挑戰。本研究關注了與致病性相關的白色念珠菌多功能糖酵解酶Adh1。現有研究表明，該酶通過醇-醛代謝調節黏附、菌絲發育和生物膜形成等毒力過程，但其具體效應或機制尚無定論。因此，研究敲除或過表達了實驗菌株CBS562的^ADH1基因。與文獻報道的^ADH1敲除破壞臨床標準菌株SC5314菌絲發育不同，CBS562反而因敲除形成了過度延伸的菌絲。觀察發現，CBS562形成的生物膜內菌絲主要以假菌絲形式存在，周圍散布大量酵母型細胞，表明CBS562具有更強的多態性。在此基礎上，敲除^ADH1介導假菌絲進一步延伸為過度伸長的真菌絲，而過表達^ADH1則促進菌株向酵母狀態轉換。CBS562表現出的靈活性為理解Adh1在多態性調控中的功能提供了機會。

基于靶點的藥物發現是新藥開發的常見策略。本研究基于野生型和^ADH1敲除菌株的生物膜模型，發現蒽醌類化合物通過Adh1發揮對白色念珠菌的生物膜抑制作用。盡管先前研究中關于活性蒽醌類的報道僅限于生物膜表型或特定基因表達，本研究嘗試從化合物靶點角度探索其作用機制。在四種以Adh1為功能靶點的蒽醌類化合物中，只有HAQ能夠在不影響白色念珠菌生長的情況下發揮最顯著的生物膜抑制活性。考慮到^ADH1的敲除或過表達也不影響菌株的生長動力學，HAQ被認為是調節Adh1、從而調整菌絲形態方向最合理的調節劑。隨后，研究反向探索了HAQ的靶蛋白。將活性低得多的大黃素作為弱結合藥物固定在環氧活化瓊脂糖微球中，然后用HAQ競爭性洗脫蛋白。質譜鑒定結果顯示靶蛋白Adh1獲得高分。隨后的差示掃描熒光法和微量熱泳動等實驗也證實了HAQ與Adh1的直接相互作用。

接下來，通過將親和純化與質譜檢測耦聯，檢測了受HAQ影響的Adh1相互作用蛋白，以探索Adh1調控白色念珠菌生物膜菌絲形成的下游信號。在以往研究中，具有白色念珠菌生物膜或菌絲抑制功能的蒽醌類化合物常表現出調節糖酵解或三羧酸循環相關基因表達、抑制代謝等活性。類似地，刪除^ADH1在抑制生物膜的同時，也調節真菌內的線粒體代謝和ATP產生。因此，在質譜數據中重點關注了與能量代謝相關的SNF1及其多個去磷酸化調節因子。研究表明，SNF1參與釀酒酵母生物膜形成的調節。在過量葡萄糖刺激下，SNF1失活將介導DNA結合蛋白Mig1易位至細胞核，阻止替代能量利用基因的表達，并通過與Tup1、Ssn6等結合負調節細胞內絮凝相關蛋白Flo11的水平，最終拮抗生物膜形成。此外，菌絲生長的負調節因子Nrg1和Nrg2也可以作為SNF1激酶的直接或間接靶點，從而參與釀酒酵母的菌絲分化和侵襲性生長。這暗示SNF1是Adh1調節白色念珠菌生物膜形成的潛在效應分子。由于缺乏市售的特異性靶向白色念珠菌蛋白的抗體，研究通過在釀酒酵母中表達帶His或Flag標簽的蛋白，通過Co-IP復核質譜信息，在此強調了HAQ下調Adh1與Ssb1或Bmh1相互作用的現象。值得注意的是，現有線索不足以解釋HAQ以及Adh1在調節SNF1磷酸化方面的機制。關于Adh1是否借助Ssb1和Bmh1調節SNF1活性，以及HAQ是否通過調節Adh1與Ssb1或Bmh1的相互作用來影響SNF1激活，需要通過干預Adh1與調節蛋白之間的相互作用來進一步證實。在SNF1磷酸化檢測結果中，Adh1緩解了白色念珠菌SNF1的激活。當^ADH1被敲除時，SNF1在生物膜誘導條件下維持高水平的磷酸化。此外，HAQ不僅下調了Adh1與SNF1去磷酸化調節因子之間的相互作用，而且還依賴Adh1發揮SNF1磷酸化抑制劑的功能。這一結果同樣為Adh1參與SNF1磷酸化調節提供了更充分的證據。

在白色念珠菌SNF1磷酸化檢測結果中觀察到了兩條免疫印跡條帶。Lambda蛋白磷酸酶處理實驗證明，觀察到的兩條條帶都是SNF1特異的磷酸化形式。敲除^SAK1使下方條帶減弱至野生型的15%，因此用該條帶來表征SNF1磷酸化。研究意外發現，常用的AMPK抑制劑Dorsomorphin以劑量依賴的方式促進了實驗菌株中SNF1的磷酸化。考慮到Dorsomorphin促進野生型和^ADH1過表達菌株發育為真菌絲，同時限制了HAQ和Adh1對菌絲形態的調節，而^SAK1敲除菌株僅呈現酵母樣狀態，且由^ADH1敲除引起的高水平SNF1磷酸化同樣介導菌株形成真菌絲，因此得出結論：白色念珠菌生物膜內機體的形態直接受SNF1磷酸化程度控制，而HAQ和Adh1借助SNF1磷酸化來調節菌絲形成。Dorsomorphin促進白色念珠菌SNF1磷酸化的免疫印跡結果在此得到確認，與文獻報道的差異歸因于物種間代謝調節的差異。由于Dorsomorphin在SNF1磷酸化Western印跡實驗中抑制上方條帶磷酸化的同時促進下方條帶磷酸化，推測Dorsomorphin可能優先抑制負責上方條帶（其他位點）磷酸化的激酶。這種抑制可能導致磷酸基團或激酶對Thr208位點的可用性相對增加，在我們的檢測中表現為對功能性（下方條帶）磷酸化的明顯整體促進。此外，實驗結果證明，促進SNF1去磷酸化的HAQ抑制菌絲延伸，而增強SNF1磷酸化的Dorsomorphin則誘導菌絲過度延伸。這些結果與SNF1磷酸化促進菌絲延伸的假設一致。然而，HAQ和Dorsomorphin在生物膜形成上表現出協同抑制效應。這種現象可能歸因于完整的菌絲多態性是生物膜正常發育所必需的。