布魯氏菌，這個(gè)聽起來有些陌生的名字，實(shí)則是一種危害巨大的病原體。它引起的布魯氏菌病是全球范圍內(nèi)最常見的人畜共患病之一，不僅嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)發(fā)展，造成牲畜流產(chǎn)和不孕，導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失，更可感染人類，引發(fā)波浪熱、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等多種慢性消耗性疾病，嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生安全。布魯氏菌之所以如此“成功”地制造持續(xù)感染，其秘訣在于它獨(dú)特的“寄生策略”——它入侵宿主細(xì)胞后，并非“流浪”于細(xì)胞質(zhì)中，而是巧妙地“安家”于一個(gè)名為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的細(xì)胞器內(nèi)，在那里建立一個(gè)被稱為復(fù)制性布魯氏菌包含空泡(rBCV)的專屬“復(fù)制工廠”。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞的“蛋白質(zhì)合成與質(zhì)檢中心”，負(fù)責(zé)合成、折疊和運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)。布魯氏菌的“入駐”無疑會(huì)擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)所謂的“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激”。面對這種壓力，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)一套名為“未折疊蛋白反應(yīng)”(UPR)的自我調(diào)節(jié)程序，旨在恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。然而，越來越多的證據(jù)表明，包括布魯氏菌在內(nèi)的許多病原體，似乎能夠“劫持”或“利用”宿主的UPR信號(hào)通路，為自己創(chuàng)造更有利的復(fù)制環(huán)境。那么，布魯氏菌究竟是如何做到這一點(diǎn)的？其外膜上那些直接與宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境接觸的蛋白質(zhì)，特別是重要的外膜蛋白(Omp)，是否在其中扮演了關(guān)鍵角色？這成為了研究人員亟待解答的科學(xué)問題。

本研究的通訊作者團(tuán)隊(duì)在《Journal of Biological Chemistry》上發(fā)表論文，深入探究了上述謎題。他們發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌的一個(gè)關(guān)鍵外膜蛋白Omp25，竟然是操控宿主UPR、促進(jìn)自身繁殖和引發(fā)炎癥的“幕后推手”。

為了揭示Omp25的作用，研究人員綜合運(yùn)用了分子與細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)及動(dòng)物模型等多種技術(shù)手段。在細(xì)胞水平，他們使用了基因過表達(dá)、報(bào)告基因活性檢測、免疫共沉淀(Co-IP)、免疫印跡(Western blot)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)以及免疫熒光共定位等技術(shù)，系統(tǒng)分析了Omp25對UPR三條分支通路（PERK、IRE1α、ATF6）及下游炎癥信號(hào)（如NF-κB）的激活作用，并明確了Omp25與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白BiP的直接相互作用。在蛋白質(zhì)相互作用方面，研究采用了GST pull-down和生物層干涉技術(shù)(BLI)驗(yàn)證結(jié)合的特異性與親和力。在感染模型方面，研究人員構(gòu)建了布魯氏菌流產(chǎn)桿菌(B. abortus)的野生型、omp25基因敲除(Δomp25)及回補(bǔ)菌株，在巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)中評(píng)估了細(xì)菌的胞內(nèi)存活與增殖，并檢測了感染后宿主細(xì)胞的UPR與炎癥應(yīng)答。此外，研究還建立了BALB/c小鼠全身感染模型和C57BL/6孕鼠感染模型，以評(píng)估Omp25在動(dòng)物體內(nèi)的致病性、組織細(xì)菌載量、UPR激活程度以及引起的組織病理損傷（特別是胎盤炎癥）。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所的生物安全三級(jí)(BSL-3)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，并獲得了相應(yīng)的倫理批準(zhǔn)。

研究人員首先進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Omp25能顯著上調(diào)UPR標(biāo)志基因BiP等的mRNA水平。進(jìn)一步的報(bào)告基因和免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Omp25能以劑量和時(shí)間依賴的方式激活UPR的所有三條核心通路：它增加了磷酸化的PERK(p-PERK)、磷酸化的eIF2α(p-eIF2α)和CHOP蛋白（PERK通路），促進(jìn)了IRE1α的自磷酸化(p-IRE1α)和XBP1 mRNA的剪接（IRE1α通路），并提升了ATF6蛋白的剪切活化形式ATF6(N)的水平（ATF6通路）。這些結(jié)果首次表明Omp25是一個(gè)強(qiáng)大的UPR激活因子。

由于活化的IRE1α可以連接NF-κB炎癥信號(hào)通路，研究人員接下來探究了Omp25是否也影響炎癥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Omp25能劑量依賴性地增強(qiáng)NF-κB報(bào)告基因的活性，并顯著上調(diào)IL6、CXCL10等促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)，但對I型干擾素相關(guān)基因無影響。使用IRE1α激酶抑制劑KIRA6或RNase抑制劑4μ8C處理，能有效抑制Omp25誘導(dǎo)的NF-κB活化和炎癥基因表達(dá)。這表明Omp25通過依賴IRE1α激酶和RNase活性的方式，激活了IRE1α-NF-κB信號(hào)軸，從而選擇性促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

Omp25如何能同時(shí)激活三條UPR通路？研究人員將目光投向了UPR的總調(diào)控蛋白——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白BiP。共聚焦顯微鏡顯示Omp25定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并與內(nèi)源性BiP共定位。免疫共沉淀、GST pull-down和BLI實(shí)驗(yàn)均證實(shí)Omp25能與BiP發(fā)生高親和力的直接相互作用，其平衡解離常數(shù)(K_D)為27.6 nM。進(jìn)一步的domain mapping顯示，Omp25特異性地與BiP的底物結(jié)合域(SBD)結(jié)合。通過AlphaFold分子對接預(yù)測并構(gòu)建了Omp25的缺失突變體(Omp25^Δ105-108)，該突變體與BiP的結(jié)合能力及其激活UPR靶基因的能力均顯著減弱，證實(shí)了特異性結(jié)合的關(guān)鍵性。

在正常狀態(tài)下，BiP與PERK、IRE1α和ATF6的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使其保持非活性狀態(tài)。研究表明，過表達(dá)Omp25能顯著減少BiP與這三個(gè)UPR傳感器之間的結(jié)合。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，加入重組Omp25蛋白能以劑量依賴的方式競爭性抑制BiP與PERK、IRE1α、ATF6腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)說明，Omp25通過直接“占據(jù)”BiP的SBD，將BiP從UPR傳感器上“撬開”，從而解除了對傳感器的抑制，觸發(fā)了全面的UPR信號(hào)。

為了驗(yàn)證Omp25在感染過程中的功能，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了布魯氏菌流產(chǎn)桿菌強(qiáng)毒株S2308和疫苗株A19的omp25缺失突變體(Δomp25)。體外感染巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，Δomp25菌株在感染后期（72小時(shí)）的胞內(nèi)存活和增殖能力顯著低于野生型菌株。同時(shí)，感染Δomp25菌株的細(xì)胞，其BiP、p-IRE1α等UPR標(biāo)志蛋白的表達(dá)，以及Bip、Chop、Il6、Tnfa等UPR與炎癥相關(guān)基因的誘導(dǎo)水平均明顯降低。用UPR激活劑衣霉素(Tm)預(yù)處理細(xì)胞，可以部分挽救Δomp25菌株的胞內(nèi)復(fù)制缺陷，而回補(bǔ)omp25基因也能部分恢復(fù)UPR激活和細(xì)菌負(fù)荷。這直接證明了Omp25通過激活UPR來支持布魯氏菌的胞內(nèi)持續(xù)增殖。

在BALB/c小鼠感染模型中，與感染野生型菌株的小鼠相比，感染Δomp25菌株的小鼠脾臟腫大程度減輕，脾臟和肝臟中的細(xì)菌載量顯著降低。組織病理學(xué)損傷也得到緩解。更重要的是，感染Δomp25菌株的小鼠，其脾臟和肝臟組織中UPR相關(guān)基因和促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)水平，以及BiP和p-IRE1α蛋白水平，均顯著低于野生型感染組。這表明Omp25在動(dòng)物體內(nèi)同樣通過促進(jìn)UPR和炎癥來增強(qiáng)布魯氏菌的致病力。

布魯氏菌在孕畜中引起嚴(yán)重胎盤炎癥和流產(chǎn)的能力是其重要致病特征。在孕鼠感染模型中，感染Δomp25菌株的小鼠，其胎盤細(xì)菌載量顯著低于野生型感染組。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，野生型感染導(dǎo)致胎盤連接區(qū)和迷路區(qū)出現(xiàn)嚴(yán)重的漿液滲出、壞死和結(jié)構(gòu)破壞，而這些病理變化在Δomp25感染組中大大減輕。基因表達(dá)分析也顯示，Δomp25感染胎盤中UPR和炎癥基因的誘導(dǎo)水平更低。這說明Omp25通過增強(qiáng)胎盤組織的UPR激活和炎癥反應(yīng)，加劇了胎盤炎癥，從而增加了流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，這項(xiàng)研究系統(tǒng)闡明了布魯氏菌外膜蛋白Omp25在操控宿主細(xì)胞應(yīng)答、建立慢性感染中的新機(jī)制。其核心結(jié)論在于：Omp25并非一個(gè)被動(dòng)的結(jié)構(gòu)蛋白，而是一個(gè)主動(dòng)的“信號(hào)操縱者”。它利用自身定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生空泡的區(qū)位優(yōu)勢，直接高親和力地結(jié)合宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的關(guān)鍵守門員——伴侶蛋白BiP的底物結(jié)合域。這一結(jié)合競爭性地破壞了BiP對三個(gè)UPR傳感器（PERK、IRE1α、ATF6）的抑制性結(jié)合，如同拔掉了UPR信號(hào)通路的“安全栓”，導(dǎo)致三條通路被全面激活。其中，IRE1α通路的激活進(jìn)一步聯(lián)動(dòng)NF-κB信號(hào)，放大了炎癥反應(yīng)。這一系列由Omp25引發(fā)的宿主細(xì)胞重編程，最終營造出一個(gè)有利于布魯氏菌長期存留和增殖的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，在動(dòng)物體內(nèi)則表現(xiàn)為更強(qiáng)的組織定植能力、更嚴(yán)重的炎癥病理損傷（尤其是在胎盤）。該研究的意義重大，它首次將布魯氏菌的一個(gè)主要外膜結(jié)構(gòu)蛋白與宿主UPR信號(hào)通路的精確調(diào)控直接聯(lián)系起來，揭示了病原體利用“結(jié)構(gòu)蛋白模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激”的一種新穎機(jī)制。這不僅深化了我們對布魯氏菌這種重要胞內(nèi)寄生菌致病機(jī)理的理解，也為對抗布魯氏菌病提供了新的思路：靶向Omp25-BiP相互作用界面，或利用Omp25介導(dǎo)的UPR激活機(jī)制，可能成為開發(fā)新型抗菌療法或構(gòu)建下一代減毒疫苗的突破口。