《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Molecular mechanism of cholesterol-dependent membrane fusion in SARS-CoV-2 entry
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本文針對SARS-CoV-2入侵過程中膽固醇調(diào)控膜融合的具體機(jī)制尚不明確這一科學(xué)問題，通過構(gòu)建體外囊泡-囊泡融合體系、單囊泡成像、細(xì)胞-細(xì)胞融合及假病毒感染實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)揭示了膽固醇通過與其C端胞質(zhì)區(qū)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRR)的棕櫚酰化修飾特異性互作，誘導(dǎo)刺突蛋白(Spike)形成寡聚簇，從而顯著增強(qiáng)病毒膜與宿主細(xì)胞膜的錨定(docking)效率，進(jìn)而促進(jìn)后續(xù)膜融合與病毒入侵。該研究闡明了膽固醇在冠狀病毒入侵中的精確調(diào)控角色，為靶向CRR-膽固醇相互作用開發(fā)廣譜抗冠狀病毒藥物提供了新靶點(diǎn)。
2019年末，一場由新型冠狀病毒SARS-CoV-2引發(fā)的疫情席卷全球。這種病毒狡猾地利用其表面的“鑰匙”——刺突蛋白(Spike)，去打開人體細(xì)胞表面的“鎖”——血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)受體，從而實(shí)現(xiàn)入侵。入侵的終極一步，是病毒的外膜與宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生融合，如同兩個肥皂泡合二為一，將病毒的遺傳物質(zhì)釋放進(jìn)細(xì)胞。然而，這個融合過程并非孤立發(fā)生，它深受細(xì)胞膜這個復(fù)雜“舞臺”的影響。細(xì)胞膜并非均一的脂質(zhì)雙分子層，其中分布著像膽固醇這樣的關(guān)鍵分子。膽固醇不僅是維持膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的“混凝土”，還能調(diào)控鑲嵌在膜中蛋白質(zhì)的構(gòu)象與功能。此前的研究已廣泛提示，膽固醇在包括SARS-CoV-2在內(nèi)的多種包膜病毒入侵中扮演著重要角色，但其精確的調(diào)控機(jī)制，尤其是在病毒膜（而非宿主細(xì)胞膜）一側(cè)的具體作用方式，仍然籠罩在迷霧之中。特別是，刺突蛋白那個伸向病毒內(nèi)部的“尾巴”——C端胞質(zhì)區(qū)，它經(jīng)歷了棕櫚酰化修飾（一種將脂肪酸鏈共價連接到蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基上的過程），被認(rèn)為可能與脂筏（富含膽固醇和鞘脂的膜微區(qū)）相互作用，但這個區(qū)域如何在膽固醇感知和病毒入侵中發(fā)揮作用，幾乎未被探索。為了撥開這層迷霧，研究人員開展了一項(xiàng)深入研究，其成果發(fā)表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊。
為了揭示膽固醇在SARS-CoV-2入侵中的精確作用，研究人員綜合運(yùn)用了多種前沿的生物物理與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)。他們首先建立了一個高度可控的體外重建系統(tǒng)，將純化的工程化刺突蛋白和ACE2蛋白分別重構(gòu)到兩組脂質(zhì)體上，模擬病毒膜和宿主細(xì)胞膜，從而實(shí)現(xiàn)了對膜脂組成的精確調(diào)控。在此基礎(chǔ)上，他們進(jìn)行了囊泡-囊泡內(nèi)容物混合的批量實(shí)驗(yàn)和單囊泡成像分析，后者包括單囊泡錨定、脂質(zhì)混合及內(nèi)容物混合 assay，能夠分解并定量分析膜融合的不同子步驟（如docking和fusion pore opening）。在細(xì)胞水平，研究人員采用了細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)（通過共培養(yǎng)表達(dá)Spike和ACE2的細(xì)胞觀察合胞體形成）和SARS-CoV-2假病毒感染實(shí)驗(yàn)（通過熒光素酶報(bào)告基因檢測感染效率）來驗(yàn)證生理相關(guān)性。為了在納米尺度觀察Spike蛋白的空間分布及其與膽固醇的共定位，他們使用了結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(SIM)超分辨成像技術(shù)。最后，為了在單分子水平解析Spike蛋白的寡聚狀態(tài)，他們開發(fā)了基于位點(diǎn)特異性生物偶聯(lián)和單分子光漂白分析的方法，對重構(gòu)在支撐脂雙層(SLB)或源自細(xì)胞膜的囊泡上的Spike蛋白進(jìn)行定量計(jì)數(shù)。
研究結(jié)果
膽固醇促進(jìn)重建體系中的刺突蛋白介導(dǎo)的膜融合
研究人員構(gòu)建了Spike1268（一種C端截短5個氨基酸以增強(qiáng)表達(dá)的工程化Spike）囊泡和ACE2囊泡體系。批量融合實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)病毒膜（Spike囊泡）含有≥10 mol%的膽固醇時，Spike介導(dǎo)的囊泡-囊融合效率顯著提升。而在宿主膜（ACE2囊泡）一側(cè)增加膽固醇，對融合效率影響輕微，僅在極高濃度(50 mol%)時表現(xiàn)出抑制，這可能是膽固醇過載改變膜流動性所致。這表明膽固醇的促進(jìn)作用主要源于病毒膜側(cè)。
膽固醇特異性增強(qiáng)Spike1268介導(dǎo)的囊泡錨定
為了區(qū)分膽固醇是影響了病毒與細(xì)胞的初始接觸（錨定）還是后續(xù)的膜合并（融合），研究人員進(jìn)行了單囊泡實(shí)驗(yàn)。單囊泡錨定實(shí)驗(yàn)顯示，增加Spike囊泡中的膽固醇含量，能顯著提高其與ACE2囊泡的錨定概率。然而，在單囊泡內(nèi)容物混合（反映完整膜融合）實(shí)驗(yàn)中，膽固醇水平的變化并未改變?nèi)诤峡状蜷_的概率。這表明，膽固醇主要通過促進(jìn)病毒膜與宿主細(xì)胞膜的初始錨定來提升整體融合效率，而對錨定后的融合動力學(xué)步驟影響甚微。
細(xì)胞膜上的膽固醇是Spike1268介導(dǎo)的細(xì)胞融合所必需的
在細(xì)胞-細(xì)胞融合模型中，使用甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)耗竭表達(dá)Spike的細(xì)胞膜上的膽固醇，可顯著抑制合胞體形成；而用MβCD-膽固醇復(fù)合物(MβCD-CHO)補(bǔ)充膽固醇后，融合能力得以恢復(fù)。類似地，用MβCD預(yù)處理SARS-CoV-2假病毒以耗盡其膜膽固醇，會顯著降低病毒感染力；補(bǔ)充膽固醇則能增強(qiáng)感染，并呈現(xiàn)出劑量依賴性的促進(jìn)或抑制效應(yīng)。這些結(jié)果在更接近生理的環(huán)境中印證了膽固醇對Spike介導(dǎo)膜融合的關(guān)鍵作用。
膽固醇誘導(dǎo)Spike1268形成簇狀結(jié)構(gòu)
為了探究膽固醇促進(jìn)錨定的機(jī)制，研究人員利用SIM超分辨成像觀察了細(xì)胞膜上Spike蛋白的分布。他們發(fā)現(xiàn)，在膽固醇充足的細(xì)胞膜上，Spike蛋白傾向于形成密度更高、直徑更大的簇狀結(jié)構(gòu)；而在膽固醇耗竭的膜上，Spike的分布則更為分散。這表明膽固醇能驅(qū)動Spike蛋白在膜上發(fā)生空間重排，形成納米尺度的聚集。
膽固醇調(diào)控Spike1268簇的寡聚狀態(tài)
通過單分子光漂白技術(shù)，研究人員在單分子水平對Spike蛋白的寡聚狀態(tài)進(jìn)行了定量。他們將一個Q3肽標(biāo)簽基因插入到Spike1268的N端（Spike1268_Q3），并利用微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(gpTGase)進(jìn)行位點(diǎn)特異性Cy5熒光標(biāo)記。將該蛋白重構(gòu)到含有或不含膽固醇的支撐脂雙層(SLB)上，或使用經(jīng)膽固醇調(diào)控的細(xì)胞膜制備的SLB進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在富含膽固醇的膜環(huán)境中，每個Spike蛋白簇中包含的Spike單體拷貝數(shù)顯著多于膽固醇缺失的膜環(huán)境。這直接證明了膽固醇能誘導(dǎo)Spike蛋白形成更高階的寡聚體。
Spike的C端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)ζ淠懝檀家蕾嚨墓δ苤陵P(guān)重要
研究人員構(gòu)建了胞質(zhì)區(qū)截短的Spike突變體（Spike1234）。在單囊泡錨定實(shí)驗(yàn)中，Spike1234囊泡失去了膽固醇對錨定的增強(qiáng)作用。SIM成像和Pearson相關(guān)性分析顯示，與全長Spike1268相比，Spike1234與膽固醇的共定位顯著減弱，且其簇狀結(jié)構(gòu)的形成不再受膽固醇水平的調(diào)控。在細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中，Spike1234介導(dǎo)的合胞體形成也對膽固醇調(diào)制不敏感。這些結(jié)果表明，Spike蛋白的C端胞質(zhì)區(qū)是感知膜膽固醇并介導(dǎo)其依賴性功能的關(guān)鍵模塊。
CRR的棕櫚酰化修飾介導(dǎo)膽固醇依賴的Spike蛋白成簇和病毒錨定效率
Spike蛋白胞質(zhì)區(qū)內(nèi)含有一個富含10個半胱氨酸的保守區(qū)域(CRR)，是棕櫚酰化的位點(diǎn)。研究人員將CRR中的所有半胱氨酸突變?yōu)楸彼幔瑯?gòu)建了突變體Spike1268_10A。該突變體喪失了與膽固醇的直接結(jié)合能力。在功能上，Spike1268_10A介導(dǎo)的囊泡融合、細(xì)胞融合均不再受膽固醇水平的調(diào)節(jié)。SIM成像顯示其無法形成膽固醇依賴性的簇狀結(jié)構(gòu)，單囊泡錨定實(shí)驗(yàn)中也觀察不到膽固醇的增強(qiáng)效應(yīng)。此外，用棕櫚酰化抑制劑2-溴棕櫚酸(2-BP)處理假病毒，能劑量依賴性地抑制病毒感染。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)有力地證明，CRR的棕櫚酰化修飾是Spike蛋白與膽固醇相互作用、進(jìn)而形成功能性寡聚簇所必需的。
結(jié)論與討論
本研究通過多層次的實(shí)驗(yàn)體系，系統(tǒng)闡明了膽固醇在SARS-CoV-2入侵中的精確分子機(jī)制。核心結(jié)論是：位于病毒膜上的膽固醇，通過與Spike蛋白C端胞質(zhì)區(qū)內(nèi)棕櫚酰化的CRR特異性相互作用，誘導(dǎo)Spike蛋白發(fā)生橫向重組，形成高階寡聚簇。這種空間納米級的重組裝，猶如在病毒表面組建了一個個“登陸平臺”，通過多價的ACE2受體結(jié)合，極大地增強(qiáng)了病毒膜與宿主細(xì)胞膜的初始錨定效率，從而為后續(xù)的膜融合與病毒入侵鋪平道路。
該研究的科學(xué)意義重大。首先，它將膽固醇對病毒入侵的促進(jìn)作用精確鎖定在“病毒膜”這一特定空間，并解析了其通過“Spike蛋白胞質(zhì)尾”這一特定分子模塊起作用，突破了以往將膽固醇作用籠統(tǒng)歸因于脂筏或膜流動性的認(rèn)知。其次，研究發(fā)現(xiàn)了膽固醇驅(qū)動Spike蛋白寡聚化這一此前未知的調(diào)控機(jī)制，為理解包膜病毒融合蛋白的活化和組織提供了新視角。最后，也是最具轉(zhuǎn)化潛力的，是研究明確了CRR及其棕櫚酰化修飾是膽固醇依賴的病毒入侵的關(guān)鍵樞紐。鑒于CRR在SARS-CoV-2及其變異株乃至其他冠狀病毒中的高度保守性，針對這一相互作用的干預(yù)（如開發(fā)抑制棕櫚酰化或競爭性結(jié)合CRR的多肽/小分子），有望成為一種不依賴于Spike受體結(jié)合域(RBD)、具有廣譜抗冠狀病毒潛力的全新治療策略。同時，研究也為臨床上探索使用安全性更高的環(huán)糊精衍生物（如HP-β-CD）通過耗竭病毒膜膽固醇來抑制感染提供了更深層的理論依據(jù)。總之，這項(xiàng)研究不僅增進(jìn)了對冠狀病毒基礎(chǔ)生物學(xué)的理解，也為應(yīng)對當(dāng)前及未來可能的冠狀病毒威脅指明了新的藥物研發(fā)方向。
