《PROTEOMICS》：Image Analysis Platform for Comprehensive Quantification of Extracellular Vesicle Morphology
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本文綜述介紹了一種用于分析透射電子顯微鏡（TEM）和單分子定位顯微鏡（SMLM）圖像的單細胞外囊泡（EV）分析流程。該流程通過對EV形態（大小、形狀）和蛋白質分布模式進行量化，成功地將EV分為密集（dense） 和復雜（complex） 兩種主要類別。研究發現，相比密集型EV，復雜型EV通常體積更大、圓度更低、形態更不規則。通過比較重組EV、細胞培養來源EV以及血漿EV，研究證明了TEM與SMLM數據間具有良好的一致性，突出了多模態成像的優勢。此外，研究還發現富集了四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）的血漿EV，其復雜型EV的比例更高。這項工作提出的圖像分析策略，為深入理解EV的異質性、闡明其生物發生機制及推動其在生物醫學中的應用提供了新的方法論工具。
引言
細胞外囊泡（EVs）是膜包裹的納米顆粒，在細胞生物學和生物醫學中扮演著關鍵角色。然而，EVs具有高度的異質性，這為其表征帶來了巨大挑戰。單EV分析方法是應對這一挑戰的重要工具。EV的形態（大小、形狀和結構特征）可為其生物學功能、起源以及潛在的生物醫學應用提供重要線索。例如，形態可以指示EV攜帶分子貨物的能力，特定形態的EV亞群可能與癌癥等疾病相關，而一致的形態則是治療應用中質量控制的重要標志。本研究旨在開發一種基于透射電子顯微鏡（TEM）和單分子定位顯微鏡（SMLM）圖像的數據分析策略，以全面量化單個EV的形態。
材料與方法
本研究使用了多種來源的EV樣本，包括商業化的重組標準EV（rEVs）、從多種細胞系（如神經母細胞瘤SH-SY5Y、乳腺癌細胞BT-474、BT-474R、SK-BR-3、JIMT-1）條件培養基中通過尺寸排阻色譜（SEC）分離的EV，以及從健康人混合血漿中通過SEC分離的EV。所有EV樣本均遵循細胞外囊泡研究國際學會（MISEV）指南進行表征，以確保其完整性和純度。
對于TEM成像，將EV樣本直接滴加在經輝光放電處理的碳膜銅網上，經去離子水清洗后，用醋酸雙氧鈾負染，最后在透射電子顯微鏡下成像。對于SMLM成像，則采用了兩種策略：一種是“單細胞外囊泡納米顯微術”（SEVEN）平臺，利用功能化抗體（抗CD9、CD63、CD81）捕獲并標記EV表面的四跨膜蛋白，然后進行SMLM成像；另一種是針對血漿總EV的成像，使用UV/臭氧處理的潔凈蓋玻片直接吸附EV，并通過CF568染料共價標記其表面后進行SMLM成像。所有SMLM的定位數據均通過NIS-Elements軟件提取。
圖像分析是本研究的核心。SMLM數據通過Nanometrix SMLM軟件（v2.4.1.3）進行分析，導入定位表后，使用DBSCAN算法對EV進行聚類識別。小于30納米或定位點少于20個的簇被排除。隨后，軟件利用卷積神經網絡模型NMTX-s1將剩余囊泡根據其表面蛋白質分布模式分為“密集”或“復雜”兩種形態類型。TEM圖像則通過Nanometrix圖像分析軟件（v1.4.1.1）處理，由基于UNet的模型NMTX-a1自動分割圖像中的顆粒。小于30納米的物體被移除，剩余囊泡被分為密集、復雜或其他類別。軟件為每個囊泡計算了一系列形態學參數，包括投影直徑、圓度、偏心率、緊密度、縱橫比，以及專門針對TEM圖像的凸面比和形狀偏度，從而對EV的大小、輪廓復雜度和形狀進行定量描述。
結果
1. 重組EV（rEVs）的形態學分析
對rEVs的TEM和SMLM圖像分析均表明，存在兩種主要類型的EV：密集型和復雜型。密集型EV定義為高度圓形、在SMLM中呈現緊湊且均勻的定位點云、在TEM負染圖像中具有均勻電子致密腔的囊泡。復雜型EV則在SMLM中顯示出不連續的定位點分布，在TEM中呈現不規則的腔對比度或多葉輪廓。兩種技術檢測到的復雜EV比例均較低（低于5%）。形態參數比較顯示，與密集型EV相比，復雜型EV具有顯著更大的尺寸、更低的圓度、更高的偏心率、緊密度和縱橫比。對于TEM圖像，復雜型EV還具有更低的凸面比和更高的形狀偏度。此外，對于兩種技術都檢測到的密集型EV，其在尺寸、偏心率、圓度和緊密度方面的平均值顯示出極好的一致性（平均差異在10%以內）。
2. 細胞系來源EV的形態學分析
對SH-SY5Y、BT-474和BT-474R細胞來源EV的SMLM分析顯示，復雜EV的比例仍然較低，其中曲妥珠單抗耐藥細胞系BT-474R的復雜EV比例最高（約5%）。與rEVs類似，來自這三個細胞系的復雜EV（相比密集型）同樣表現出更大的尺寸、更低的圓度以及更高的偏心率、緊密度和縱橫比。在不同細胞系間，SH-SY5Y來源的密集型EV平均尺寸最大、圓度最高，而BT-474R來源的密集型EV則平均尺寸最小、圓度最低、偏心率最高。TEM圖像分析結果與SMLM數據基本吻合，但在部分樣本（如SH-SY5Y和BT-474）的TEM圖像中，還檢測到了被標記為“其他”的第三類顆粒，它們尺寸非常小（20-50納米）、高度圓形，且不表達四跨膜蛋白信號，可能代表了無四跨膜蛋白的小EV或其他納米顆粒污染物。
3. 過表達HER2的細胞系EV比較
對HER2過表達的乳腺癌細胞系SK-BR-3（曲妥珠單抗敏感）和JIMT-1（曲妥珠單抗耐藥）來源EV的SMLM分析顯示，JIMT-1細胞分泌的EV中復雜EV的比例略高于SK-BR-3。與SK-BR-3 EVs相比，JIMT-1 EVs（無論是密集型還是復雜型）平均尺寸更大、圓度更高，但緊密度和縱橫比的平均值更低。
4. 血漿來源EV：總EV與四跨膜蛋白富集EV的比較
為了評估四跨膜蛋白陽性與“總”EV群體，研究比較了從健康人血漿中分離的EV。通過SMLM分別成像了用CF568染料標記的總EV群體，以及用熒光抗體標記的四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）富集EV群體。分析發現，四跨膜蛋白富集的EV群體中，復雜EV的比例高于總EV群體。在形態上，兩組EV的整體分布和平均值相似。總EV（與四跨膜蛋白富集EV相比）的密集型平均尺寸略小，復雜型平均尺寸也略小，但兩組EV的尺寸異質性相似。總EV的伸長程度略低，但整體形狀，尤其是密集型EV的形狀，非常相似。
討論
本研究提出了一種新的TEM和SMLM圖像分析策略，用于全面確定EV的形態。研究證明了兩種單EV成像技術所獲結果之間具有良好的一致性，并指出了每種方法的優勢。通過優化的分析流程，EV可被穩健地分為密集和復雜兩種群體，并且在不同來源的EV中觀察到了一致的趨勢。TEM還能額外揭示“其他”類別的非常小的顆粒。
然而，在分析數據時，必須考慮圖像獲取所采用的實驗方案。對于TEM，雖然本研究使用的整體負染方案步驟較少、化學更溫和，但脫水過程可能引入樣品變形，影響對原生形態的解讀。對于SMLM，其受非EV顆粒雜質的影響較小，特別是與SEVEN等親和平臺結合時。但確保EV表面被標記物良好覆蓋，以及使用具有高結合能力的特異性親和試劑至關重要。對于總EV的無表位依賴性附著，UV/臭氧處理玻璃是一種有效策略，但可能無法附著所有EV。
總之，對EV形態的全面描述以及技術間的交叉驗證，為EV分類提供了新工具。這在機器學習應用中尤其重要，額外的EV參數信息有助于更好地定義目標EV群體。這項工作推進了EV研究的方法學工具箱，為改善EV在生物學和生物醫學中的表征奠定了基礎。
