新型EZH2-DNMT3A級(jí)聯(lián)對(duì)JAM-A的表觀遺傳調(diào)控通過(guò)激活Rap1a增強(qiáng)狼瘡患者T細(xì)胞黏附的機(jī)制研究
《Journal of Translational Autoimmunity》：A novel epigenetic regulation of JAM-A by EZH2-DNMT3A cascade contributes to T cell adhesion via the activation of Rap1a in lupus patients
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本研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者T細(xì)胞中，EZH2/H3K27me3通過(guò)抑制DNMT3A表達(dá)，降低JAM-A啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，從而上調(diào)JAM-A表達(dá)。激活的JAM-A通過(guò)Rap1a/β1整合素信號(hào)通路增強(qiáng)T細(xì)胞黏附能力，而miR-26a-5p與EZH2形成負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路。靶向抑制EZH2可有效緩解小鼠狼瘡模型病情，為SLE治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡，一種累及全身多器官的自身免疫性疾病，就像一個(gè)免疫系統(tǒng)“認(rèn)友為敵”的混亂戰(zhàn)場(chǎng)。其中，活化的炎癥性T細(xì)胞浸潤(rùn)器官是導(dǎo)致組織損傷的關(guān)鍵步驟，而這個(gè)“入侵”過(guò)程離不開(kāi)細(xì)胞黏附與遷移分子的幫助。連接黏附分子A，這個(gè)通常在上皮細(xì)胞緊密連接處維持“邊防”的蛋白，被發(fā)現(xiàn)可能在T細(xì)胞的“越境”行為中扮演著重要角色。同時(shí)，科學(xué)家們注意到，在SLE患者的T細(xì)胞中，存在著廣泛的表觀遺傳調(diào)控異常，比如組蛋白修飾和DNA甲基化的改變，這被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)疾病發(fā)生發(fā)展的“幕后黑手”。那么，這兩者之間是否存在聯(lián)系？一種名為EZH2的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，其異常表達(dá)已被發(fā)現(xiàn)在多種疾病中起作用，它是否會(huì)與JAM-A“聯(lián)手”，共同導(dǎo)演SLE中T細(xì)胞的異常黏附與遷移這場(chǎng)“戲”呢？為了揭開(kāi)這個(gè)謎團(tuán)，由云南大學(xué)崔清華、丁磊等人領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了深入探索，相關(guān)成果發(fā)表在《Journal of Translational Autoimmunity》上。
為了回答上述問(wèn)題，研究人員運(yùn)用了多種關(guān)鍵技術(shù)。他們首先采集了SLE患者和健康志愿者的外周血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞和T細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。在細(xì)胞模型上，他們使用了EZH2的特異性抑制劑GSK126或小干擾RNA來(lái)敲低EZH2或JAM-A的表達(dá)，也通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)JAM-A。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)分析了H3K27me3和DNMT3A在靶基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況，并通過(guò)亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR檢測(cè)了JAM-A啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化水平。細(xì)胞黏附能力則通過(guò)Boyden小室體外黏附實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。此外，研究還利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-26a-5p與EZH2、Rap1a的靶向關(guān)系，并在MRL/lpr自發(fā)性狼瘡小鼠模型上進(jìn)行了in vivo藥效評(píng)價(jià)。
3.1. JAM-A和EZH2在SLE患者PBMCs和T細(xì)胞中的表達(dá)增加
研究人員發(fā)現(xiàn)，與健康供者相比，SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞和T細(xì)胞中JAM-A和EZH2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)。未接受治療的新發(fā)SLE患者（高JAM-A染色組）中JAM-A陽(yáng)性細(xì)胞比例更高，而經(jīng)臨床治療后（低JAM-A染色組）該比例下降，提示JAM-A和EZH2是與SLE疾病活動(dòng)性相關(guān)的激活因子。
3.2. JAM-A受EZH2修飾的DNMT3A甲基化調(diào)控
有意思的是，通常作為轉(zhuǎn)錄抑制因子的EZH2，其表達(dá)卻與JAM-A正相關(guān)。機(jī)制研究表明，在T細(xì)胞或Jurkat細(xì)胞中使用GSK126抑制劑或EZH2 siRNA敲低EZH2后，H3K27me3水平下降，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A（而非DNMT1或DNMT3B）的表達(dá)反而上調(diào)。這導(dǎo)致JAM-A基因啟動(dòng)子區(qū)域（-275至+247 bp）的甲基化水平升高，從而抑制了JAM-A的表達(dá)。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制EZH2后，H3K27me3在DNMT3A啟動(dòng)子近端區(qū)域的占據(jù)減少，而DNMT3A在JAM-A轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域上游的結(jié)合增強(qiáng)。在SLE患者T細(xì)胞中，DNMT3A的mRNA表達(dá)與EZH2、JAM-A的mRNA表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果揭示了EZH2通過(guò)H3K27me3抑制DNMT3A，進(jìn)而由DNMT3A去甲基化激活JAM-A表達(dá)的級(jí)聯(lián)調(diào)控機(jī)制。
3.3. 抑制EZH2和JAM-A可抑制β1整合素依賴的T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的黏附
SLE的特征之一是T細(xì)胞過(guò)度活化的黏附和遷移。體外黏附實(shí)驗(yàn)表明，SLE患者T細(xì)胞的黏附能力高于健康對(duì)照。用GSK126或EZH2 siRNA處理T細(xì)胞或Jurkat細(xì)胞，其黏附能力顯著降低。使用中和抗體J10.4阻斷JAM-A的同源二聚化，同樣能減少細(xì)胞對(duì)基質(zhì)包被濾膜的黏附。機(jī)制上，在Jurkat細(xì)胞中過(guò)表達(dá)JAM-A可上調(diào)Rap1a和β1整合素的表達(dá)并增強(qiáng)細(xì)胞黏附；反之，敲低JAM-A則產(chǎn)生相反效果。這證明JAM-A通過(guò)調(diào)節(jié)Rap1a/β1整合素信號(hào)通路來(lái)調(diào)控T細(xì)胞的黏附能力。
3.4. EZH2與miR-26a-5p之間的負(fù)反饋環(huán)路
研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了微觀層面的精細(xì)調(diào)控。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和驗(yàn)證，他們確定miR-26a-5p可以直接靶向EZH2。在T細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-26a-5p模擬物，可下調(diào)EZH2和H3K27me3的表達(dá)。反過(guò)來(lái)，抑制EZH2的表達(dá)（用GSK126或siRNA）則會(huì)上調(diào)miR-26a-5p的水平。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，抑制EZH2后，H3K27me3在miR-26a-5p宿主基因CTDSPL和CTDSP2啟動(dòng)子區(qū)域的富集減少。這表明miR-26a-5p直接靶向EZH2，而miR-26a-5p自身又受到EZH2介導(dǎo)的H3K27組蛋白三甲基化的表觀遺傳抑制，從而形成了一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-26a-5p也能靶向Rap1a，從而在多個(gè)層面參與調(diào)控。
3.5. 用GSK126抑制EZH2可改善MRL/lpr小鼠的狼瘡樣疾病表型
為了驗(yàn)證靶向EZH2的治療潛力，研究在MRL/lpr自發(fā)性狼瘡小鼠模型中使用了EZH2高選擇性抑制劑GSK126。結(jié)果顯示，GSK126治療能顯著提高小鼠存活率，降低血漿中抗雙鏈DNA抗體滴度，減少脾臟中白細(xì)胞介素-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的表達(dá)，并減輕腎臟腎小球的病理?yè)p傷。免疫組化顯示，小鼠腎臟中JAM-A和β1整合素的表達(dá)也明顯降低。蛋白印跡分析證實(shí)，GSK126治療降低了脾細(xì)胞中EZH2、H3K27me3、JAM-A、Rap1a和β1整合素的表達(dá)，同時(shí)升高了DNMT3A的表達(dá)。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制EZH2能夠有效緩解狼瘡樣疾病的進(jìn)展。
綜合以上研究結(jié)果，本文得出結(jié)論：在SLE患者T細(xì)胞中，EZH2表達(dá)上調(diào)，通過(guò)催化產(chǎn)生H3K27me3抑制了DNMT3A的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致JAM-A啟動(dòng)子區(qū)低甲基化和其表達(dá)升高。高表達(dá)的JAM-A通過(guò)激活Rap1a/β1整合素信號(hào)通路，增強(qiáng)了T細(xì)胞的黏附能力。與此同時(shí)，EZH2與miR-26a-5p之間形成了一個(gè)負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路，并且miR-26a-5p也靶向抑制Rap1a，構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最終，這共同導(dǎo)致了T細(xì)胞過(guò)度黏附和遷移，參與SLE的發(fā)病過(guò)程。
這項(xiàng)研究的意義重大。首先，它首次系統(tǒng)地闡明了EZH2通過(guò)表觀遺傳級(jí)聯(lián)（EZH2/H3K27me3 → DNMT3A → JAM-A）調(diào)控T細(xì)胞黏附分子表達(dá)的新機(jī)制，為理解SLE的免疫病理機(jī)制提供了新的視角。其次，研究揭示了EZH2、miR-26a-5p、JAM-A和Rap1a之間構(gòu)成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，展現(xiàn)了疾病中多層面調(diào)控的交互作用。最重要的是，研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，靶向抑制EZH2（使用GSK126）能夠有效逆轉(zhuǎn)上述異常調(diào)控，并緩解狼瘡模型小鼠的疾病癥狀，這為SLE的治療提供了一個(gè)極具潛力的新靶點(diǎn)。JAM-A和EZH2有可能成為SLE疾病活動(dòng)性的診斷生物標(biāo)志物，而針對(duì)EZH2-JAM-A軸的干預(yù)策略，例如使用EZH2抑制劑，有望發(fā)展為未來(lái)SLE治療的新方法。
