轉運RNA衍生的小RNA（tsRNAs）是成熟或前體tRNA經位點特異性切割產生的，已成為重要的調控分子。tsRNAs繼承自母本tRNA的大量化學修飾，這些修飾可能賦予其不同于未修飾版本的獨特生物學活性。其中，胞嘧啶-5甲基化（m⁵C）是一種廣泛存在的tRNA修飾。NOP2/Sun RNA甲基轉移酶6（NSUN6）可特異性催化tRNA-Cys (GCA)等第72位胞嘧啶（C72）的m⁵C修飾。然而，m⁵C修飾的tsRNAs在膀胱癌（BC）中的生物學作用和調控機制尚不清楚。另一方面，組蛋白乳酸化是一種由細胞內乳酸驅動的新近發現的代謝-表觀遺傳修飾，與轉錄激活相關，在癌癥進展中發揮作用，但其上游的表觀轉錄組調控信號 largely unknown。

為探索m⁵C修飾tsRNAs在BC中的功能，研究團隊在SV-HUC-1（正常尿路上皮細胞）、CdCl₂轉化的惡性細胞（Cd-SV-HUC-1）和T24（BC細胞）中進行了m⁵C特異性甲基化小RNA免疫共沉淀（RIP）微陣列分析。通過比較分析，他們發現并聚焦于一個在惡性轉化細胞中共同下調的m⁵C修飾tsRNA：m⁵C-tRF3b-Cys^GCA-23，將其命名為mtRC。進一步的tRNA亞硫酸氫鹽測序確認了其修飾位點位于母本tRNA的C72。通過m⁵C免疫共沉淀-3’/5’接頭連接RT-PCR和Northern blot實驗證實，mtRC在Cd-SV-HUC-1和T24細胞中的表達水平顯著低于SV-HUC-1細胞。在臨床BC組織樣本、CdCl₂誘導的多階段大鼠膀胱癌模型組織，以及BC患者和模型大鼠的尿液標本中，mtRC的豐度均顯著降低，并與致癌進展程度呈負相關，提示mtRC可能作為膀胱癌發生的生物標志物。5C-tRF3b-CysGCA-23 (mtRC) in transformed urothelial cells and bladder cancer (BC) cells.">

功能實驗表明，抑制mtRC可促進SV-HUC-1、Cd-SV-HUC-1和T24細胞的增殖。相反，過表達其未修飾的對應物tRF3b-Cys^GCA-23（tRC）對細胞增殖沒有影響，而過表達mtRC則能顯著抑制細胞增殖，這表明mtRC的生物學功能依賴于m⁵C修飾。在T24細胞裸鼠移植瘤模型中，瘤內注射mtRC的激動劑（agomir）能顯著抑制腫瘤的生長和體積，而tRC的激動劑則無此效果，進一步在體內驗證了mtRC修飾依賴性的腫瘤抑制作用。5C-tRF3b-Cys^GCA-23 suppresses BC growth.">

機制上，mtRC來源于tRNA-Cys (GCA)并攜帶位點特異性的m⁵C標記。研究證實，該修飾位點確實位于C72。已知NSUN6是催化該位點m⁵C修飾的甲基轉移酶。在NSUN6敲低的Cd-SV-HUC-1細胞中，m⁵C特異性甲基化小RNA RIP微陣列分析顯示，包括mtRC在內的四個來源于C72 m⁵C修飾母本tRNA的m⁵C-tsRNAs顯著下調。點雜交和Northwestern blot實驗顯示，NSUN6敲低降低了整體m⁵C水平，而過表達則增加其水平。相應地，m⁵C IP-3’/5’接頭連接RT-PCR實驗證明，NSUN6敲低顯著降低mtRC豐度，而過表達則增加mtRC水平。在J82細胞中也得到了類似結果。這些數據確立了NSUN6是mtRC豐度的上游決定因素。

對公共數據集和實驗模型的分析顯示，NSUN6在高級別、晚期BC組織中表達降低，在BC細胞系中表達也低于正常尿路上皮細胞。功能上，敲低NSUN6能增強Cd-SV-HUC-1和J82細胞的增殖能力，而過表達NSUN6則抑制T24細胞增殖。生存分析顯示，NSUN6高表達的患者生存期更長。這些結果表明NSUN6在BC中發揮腫瘤抑制調節作用。

為探索mtRC抑制膀胱腫瘤發生的機制，研究合成了生物素標記的tRC、mtRC和陰性對照探針進行RNA pull-down實驗。質譜分析及后續驗證發現，只有RNA結合基序蛋白4（RBM4）特異性地與mtRC結合，RNA免疫共沉淀（RIP）實驗進一步證實了該相互作用。通過構建GFP標記的RBM4截短體，RIP實驗確定mtRC與RBM4的第II結構域結合。Western blot和免疫熒光實驗表明，過表達mtRC能上調RBM4蛋白水平，而過表達tRC則無此效應。細胞核質分離實驗顯示mtRC主要分布在細胞質。環己酰亞胺（CHX）追蹤實驗證明mtRC延長了RBM4蛋白的半衰期。泛素化實驗表明，mtRC通過抑制RBM4的泛素化/蛋白酶體依賴性降解來增強其穩定性。

在多階段膀胱癌大鼠模型中，RBM4在CK5陽性尿路上皮細胞中的表達隨著CdCl₂處理時間延長而逐漸降低。在Cd-SV-HUC-1和BC細胞系中，RBM4蛋白水平也低于SV-HUC-1細胞。功能上，敲低RBM4能增強Cd-SV-HUC-1和5637細胞的增殖，而過表達RBM4則抑制T24細胞增殖以及BC患者來源的類器官生長，支持其腫瘤抑制角色�；貜蛯嶒灡砻�，過表達RBM4可以挽救mtRC敲低引起的增殖增強，而敲低RBM4則可以部分逆轉mtRC過表達對T24細胞增殖的抑制。在裸鼠移植瘤模型中，RBM4敲低也能部分逆轉mtRC過表達對腫瘤生長的抑制作用，表明mtRC主要通過RBM4抑制BC細胞生長。

對RBM4敲低的Cd-SV-HUC-1細胞進行RNA-seq分析，KEGG通路富集顯示差異表達基因主要富集在糖酵解通路。細胞外酸化率（ECAR）實驗證實，敲低RBM4增強了Cd-SV-HUC-1和5637細胞的糖酵解能力，而過表達mtRC則抑制了T24和5637細胞的糖酵解。重要的是，過表達RBM4可以挽救由mtRC敲低引起的糖酵解增強。RT-qPCR證實RBM4敲低上調了多個糖酵解相關基因的表達。進一步機制探索發現，RBM4并不通過調節糖酵解基因ALDOC的可變剪接來發揮作用。已知RBM4可通過靶向STAT1調節糖酵解，而STAT1是調控多個糖酵解基因表達的轉錄因子。本研究發現，RBM4敲低上調了STAT1的mRNA和蛋白水平。RIP實驗表明RBM4與STAT1 mRNA結合，且RBM4敲低降低了這種結合，并增加了STAT1 mRNA的穩定性。在RBM4敲低的細胞中再次敲低STAT1，可降低多個糖酵解基因（ALDOA, ALDOC, BPGM, HK2, PDK1, ENO1）的表達。這些結果表明，RBM4至少部分是通過 destabilizing STAT1 mRNA，從而減弱STAT1依賴的糖酵解基因轉錄，來抑制糖酵解能力。

由于mtRC抑制糖酵解，研究進一步探究了其對乳酸生成和組蛋白乳酸化的影響。mtRC過表達顯著降低了T24細胞中的乳酸水平。用糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）或草氨酸鈉處理，或敲低乳酸脫氫酶A（LDHA）和B（LDHB），均能以劑量依賴的方式降低整體蛋白質乳酸化（pan-Kla）和組蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）水平。值得注意的是，mtRC過表達也顯著降低了整體乳酸化和H3K18la水平。添加外源性乳酸鈉可以恢復LDHA/LDHB敲低或mtRC過表達細胞中的H3K18la水平。在BC細胞系中，整體乳酸化和H3K18la水平顯著高于SV-HUC-1細胞。功能上，敲低LDHA/LDHB強烈抑制了Cd-SV-HUC-1和T24細胞的增殖，而乳酸鈉處理可部分恢復這種被抑制的生長。同樣，mtRC過表達對細胞增殖的抑制作用也可被乳酸鈉處理部分挽救。這些數據表明，mtRC通過限制乳酸生產來降低組蛋白H3K18乳酸化，而H3K18la促進BC細胞增殖。

為鑒定mtRC下游受H3K18la調控的轉錄程序，研究對mtRC過表達的T24細胞進行了RNA-seq，并結合已發表的T24細胞H3K18la ChIP-seq數據、CUT&Tag結果、RBM4敲低后上調的基因等信息進行交集分析，最終將IL1RAP和VASH2確定為候選靶基因。在mtRC過表達細胞中，IL1RAP和VASH2的mRNA水平顯著下調。染色質免疫共沉淀（ChIP）分析顯示，H3K18la富集在IL1RAP和VASH2的啟動子區域，且這種富集在mtRC過表達后減弱。蛋白水平上，糖酵解抑制劑或mtRC過表達均能降低IL1RAP和VASH2的蛋白表達，而乳酸鈉補充則可上調其表達。公共數據集分析顯示，IL1RAP在BC組織中上調且高表達與不良預后相關；VASH2高表達也與患者較差預后相關。在BC細胞系中，IL1RAP和VASH2蛋白表達上調。功能上，敲低IL1RAP或VASH2能顯著抑制T24和5637細胞的體外增殖，并在裸鼠移植瘤模型中抑制腫瘤生長。這些發現確定IL1RAP和VASH2是H3K18乳酸化密切相關的致癌效應因子。

本研究首次揭示了NSUN6依賴的m⁵C修飾tsRNA——mtRC在BC中的關鍵抑癌作用。mtRC在BC組織和尿液中表達下調，與惡性進展負相關，具有作為生物標志物的潛力。NSUN6作為mtRC豐度的上游調控因子，本身在BC中也發揮腫瘤抑制作用。機制上，mtRC通過直接結合RBM4并阻斷其泛素化降解來穩定RBM4蛋白。RBM4通過 destabilizing STAT1 mRNA來抑制STAT1的表達，進而下調其調控的多個糖酵解基因，最終抑制糖酵解和乳酸生成。降低的乳酸水平導致組蛋白H3K18乳酸化水平下降，從而減弱其對下游致癌基因IL1RAP和VASH2的轉錄激活，最終抑制BC的惡性進展。

研究采用了多種實驗技術，包括Arraystar Human m⁵C小RNA修飾微陣列、tRNA亞硫酸氫鹽測序、m⁵C免疫共沉淀-3’/5’接頭連接RT-PCR、Northern blot、Northwestern blot、RNA pull-down、RNA免疫共沉淀（RIP）、蛋白質泛素化分析、染色質免疫共沉淀（ChIP）、細胞外酸化率（ECAR）檢測、細胞增殖實驗（CCK-8, EdU）、患者來源類器官培養以及裸鼠皮下移植瘤模型等。臨床樣本和動物實驗均獲得了相關倫理委員會的批準。

總結而言，該研究勾勒出一條mtRC/RBM4/糖酵解/H3K18la/IL1RAP&VASH2調控軸，將tsRNA的表觀轉錄組修飾與代謝-表觀遺傳轉錄調控聯系起來，為BC的發病機制提供了新的見解，并為診斷和治療策略的開發提供了新的潛在靶點。5C-modified tsRNA, binds and stabilizes RBM4. RBM4 in turn destabilizes STAT1 mRNA, suppressing glycolysis and reducing lactate production. Decreased lactate leads to lower H3K18 lactylation, which dampens the transcription of oncogenic targets IL1RAP and VASH2, ultimately restraining bladder cancer progression.">