有絲分裂過(guò)程中的染色體凝縮對(duì)于準(zhǔn)確的染色體分離至關(guān)重要。這一過(guò)程由動(dòng)態(tài)的組蛋白修飾驅(qū)動(dòng)，如磷酸化和甲基化。其中，H3S10磷酸化（H3S10ph）和H3K9三甲基化（H3K9me3）是關(guān)鍵的有絲分裂特異性修飾。H3K9me3作為異染色質(zhì)蛋白1（HP1）的結(jié)合平臺(tái)，協(xié)調(diào)染色體乘客復(fù)合體（CPC）的定位和激活。CPC由Aurora B激酶、INCENP、borealin和survivin組成，確保有絲分裂期間的染色體穩(wěn)定性。HP1對(duì)CPC的早期招募激活了Aurora B，促進(jìn)H3S10ph，并驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)壓縮。盡管這些修飾已被充分研究，但精氨酸甲基化等其他組蛋白修飾與染色體凝縮之間的相互作用仍未得到充分探索。共激活因子相關(guān)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（CARM1，也稱(chēng)為PRMT4）已成為細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在G2/M轉(zhuǎn)換期間，CARM1在S217和S229位點(diǎn)的磷酸化會(huì)抑制其酶活性并觸發(fā)其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。然而，CARM1的酶活性抑制在有絲分裂中是否必要尚不完全清楚。染色體凝縮是一個(gè)轉(zhuǎn)錄沉默的過(guò)程，需要去除活躍標(biāo)記并積累抑制性標(biāo)記。考慮到CARM1產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活躍標(biāo)記，如H3R17me2a和H3R26me2a，我們假設(shè)CARM1失活對(duì)于通過(guò)防止這些活躍標(biāo)記的形成來(lái)實(shí)現(xiàn)正確的染色體凝縮至關(guān)重要。

為研究有絲分裂期間CARM1對(duì)組蛋白底物甲基化的動(dòng)態(tài)變化，我們分析了10T1/2細(xì)胞（正常小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）整個(gè)細(xì)胞周期中組蛋白精氨酸甲基化水平。正如預(yù)期，CARM1依賴(lài)性標(biāo)記H3R17me2a和H3R26me2a的水平從G2期開(kāi)始下降，與有絲分裂進(jìn)入時(shí)CARM1酶活性的抑制相吻合，并在有絲分裂退出后恢復(fù)。相反，由PRMT6催化的H3R2me2a在有絲分裂期間增加。重要的是，在H3R2甲基化缺陷突變體（H3R2K或H3R2A）過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，有絲分裂期間H3R17me2a水平的降低不如野生型（WT）細(xì)胞明顯。這支持了PRMT6介導(dǎo)的R17甲基化更傾向于發(fā)生在R2未甲基化時(shí)的觀點(diǎn)。因此，我們假設(shè)H3R17me2a和H3R2me2a都會(huì)影響H3S10ph和染色體凝縮。在諾考達(dá)唑（nocodazole）阻滯的有絲分裂細(xì)胞中，CARM1敲低導(dǎo)致H3R17me2a水平更大幅度的降低和H3S10ph水平的同步增加。而PRMT6敲低（降低了H3R2me2a水平）并未顯著影響H3R17me2a水平或?qū)е翲3S10ph水平的大幅增加，表明H3R17在H3S10ph中起關(guān)鍵作用。實(shí)際上，由CARM1敲低或特異性抑制劑（TP-064）引起的H3R17me2a水平降低增加了諾考達(dá)唑誘導(dǎo)的H3S10ph水平并縮短了有絲分裂持續(xù)時(shí)間。這些發(fā)現(xiàn)表明，有絲分裂期間CARM1的抑制會(huì)降低H3R17me2a，從而引發(fā)H3S10ph的增加，促進(jìn)染色體凝縮。

為了研究H3R17me2a水平下降如何影響H3S10ph水平增加，我們首先檢測(cè)了CARM1敲低或過(guò)表達(dá)（WT或E266Q突變體）細(xì)胞中CPC亞基的水平。我們觀察到，只有Aurora B水平隨著CARM1 WT過(guò)表達(dá)而降低，并隨著CARM1敲低或E266Q過(guò)表達(dá)而在蛋白和mRNA水平上增加。這表明盡管H3R17me2a是一個(gè)公認(rèn)的活躍標(biāo)記，但它可能抑制Aurkb轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)Aurora B的豐度。TP-064處理（降低了H3R17me2a水平）增加了Aurora B蛋白和mRNA水平。此外，在CARM1敲除（KO）細(xì)胞中，通過(guò)WT CARM1（而非ΔNLS-CARM1）拯救來(lái)恢復(fù)H3R17me2a，導(dǎo)致Aurora B蛋白和mRNA水平降低。直接證據(jù)來(lái)自過(guò)表達(dá)H3R17K或H3R17A形式，這增加了Aurora B和H3S10ph水平，導(dǎo)致更快的諾考達(dá)唑誘導(dǎo)的有絲分裂停滯和更窄的中期板寬度。相比之下，過(guò)表達(dá)甲基化模擬物H3R17F或磷酸化缺陷型H3S10A則產(chǎn)生了相反的結(jié)果，支持了H3R17me2a減少上調(diào)Aurkb轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)H3S10ph、染色體凝縮和有絲分裂進(jìn)入的觀點(diǎn)。值得注意的是，Aurora B激酶對(duì)其底物的活性并未因H3R17甲基化狀態(tài)而改變�？傊�，這些發(fā)現(xiàn)表明，在有絲分裂期間，CARM1抑制導(dǎo)致H3R17me2a減少，進(jìn)而增加Aurora B表達(dá)及其染色質(zhì)結(jié)合，最終提升H3S10ph水平并促進(jìn)染色體凝縮和有絲分裂進(jìn)程。

接下來(lái)，我們?cè)噲D確定H3R17me2a的減少如何增加Aurora B與染色體的結(jié)合�？紤]到CPC向染色體的招募依賴(lài)于H3K9me3結(jié)合的HP1與INCENP之間的相互作用，我們首先關(guān)注H3R17me2a和H3K9me3之間的交互作用。有趣的是，H3K9me3水平在H3R17甲基化缺陷突變體（H3R17K和H3R17A）中增加，而在H3R17甲基化模擬突變體（H3R17F）中降低。這種模式與我們觀察到的Aurora B表達(dá)和H3S10ph水平的變化一致�？傮w而言，類(lèi)似于H3R17me2a和H3S10ph之間的關(guān)系，整個(gè)細(xì)胞周期中H3R17me2a和H3K9me3標(biāo)記的變化呈負(fù)相關(guān)。即使在CARM1敲低導(dǎo)致H3R17me2a水平降低的情況下，H3K9me3水平也增加了，這強(qiáng)烈表明H3R17甲基化在調(diào)節(jié)H3K9甲基化中起作用。由于Suv39h1和Suv39h2是催化H3K9me3的已知酶，我們研究了H3R17me2a是否影響它們與染色質(zhì)的結(jié)合。在H3R17me2a水平降低的條件下（CARM1 KO、敲低或抑制），Suv39h2不受影響；然而，Suv39h1更強(qiáng)烈地結(jié)合染色質(zhì)，增加了H3K9me3水平，進(jìn)而導(dǎo)致Aurora B與染色質(zhì)結(jié)合增加和H3S10ph水平升高。只有在過(guò)表達(dá)H3R17F的組中，Suv39h1的招募被抑制，隨后H3K9me3以及染色質(zhì)結(jié)合的Aurora B和H3S10ph水平下降。這些發(fā)現(xiàn)表明，H3R17me2a和H3K9me3之間的相互作用是通過(guò)Suv39h1與染色質(zhì)的結(jié)合介導(dǎo)的。此外，Suv39h1優(yōu)先催化R17未甲基化的H3上的K9me3，而Suv39h2則不論R17甲基化狀態(tài)如何都能誘導(dǎo)K9me3。這一結(jié)果表明，H3R17甲基化改變了Suv39h1的底物偏好。總之，這些觀察結(jié)果強(qiáng)烈表明，H3R17me2a是通過(guò)Suv39h1介導(dǎo)的H3K9me3和隨后的H3S10ph來(lái)抑制染色體凝縮和有絲分裂進(jìn)入的關(guān)鍵標(biāo)記。

雖然我們已經(jīng)闡明了H3R17me2a的減少如何促進(jìn)染色體凝縮，但H3R17me2a水平在有絲分裂期間如何動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的基本問(wèn)題仍未得到解答。精氨酸甲基化被認(rèn)為是體內(nèi)可逆的過(guò)程；然而，真正的精氨酸去甲基化酶（RDM）尚未被鑒定。最近的一項(xiàng)研究表明，某些賴(lài)氨酸去甲基化酶（KDM），包括KDM3A和KDM4A，具有RDM活性，盡管主要是在體外。這表明某些KDM的精氨酸去甲基化發(fā)生在特定的體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境中。然后我們檢測(cè)了KDM3A、KDM4A、KDM4C、KDM4E、KDM5C、KDM6B、KDM7B或Jumonji結(jié)構(gòu)域蛋白6（JMJD6）是否能在體內(nèi)使H3R17me2a去甲基化。其中，KDM3A和KDM4A都顯示出強(qiáng)大的RDM活性，代表了其已確立的KDM活性之外的功能擴(kuò)展。因此，我們將研究重點(diǎn)放在這兩種酶上。過(guò)表達(dá)KDM3A或KDM4A導(dǎo)致H3R17me2a水平急劇下降，伴隨著Aurkb轉(zhuǎn)錄增加、諾考達(dá)唑處理誘導(dǎo)的H3S10ph水平升高以及明顯的有絲分裂停滯。這些結(jié)果與在CARM1缺陷細(xì)胞中觀察到的效果非常相似。相反，敲低KDM3A或KDM4A會(huì)損害RO-3306釋放后有絲分裂進(jìn)程中H3R17me2a的減少，導(dǎo)致H3S10ph水平上升較慢，表明有絲分裂進(jìn)程明顯延遲。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明KDM3A和KDM4A作為CARM1的對(duì)立物，調(diào)節(jié)H3R17me2a水平，進(jìn)而影響Aurora B水平和G2/M轉(zhuǎn)換。

先前的研究表明，重組KDM3A和KDM4A在體外未能使H3R17me2a肽段去甲基化。然而，我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示KDM3A和KDM4A表現(xiàn)出RDM活性，有效擦除H3R17me2a標(biāo)記。基于此，我們假設(shè)KDM3A和KDM4A在有絲分裂期間獲得了使H3R17me2a去甲基化的能力。鑒于有絲分裂期間會(huì)發(fā)生大規(guī)模的磷酸化波，我們首先檢查了KDM3A或KDM4A是否在此階段被磷酸化。在G2晚期和有絲分裂期觀察到KDM4A的條帶偏移，表明發(fā)生了磷酸化。事實(shí)上，KDM4A磷酸化在諾考達(dá)唑阻滯的有絲分裂細(xì)胞中顯著增加，而KDM3A未檢測(cè)到變化。與KDM1A（在有絲分裂期間被磷酸化并從染色質(zhì)釋放）不同，KDM4A無(wú)論其磷酸化狀態(tài)如何都保持與染色質(zhì)結(jié)合，這表明KDM4A在整個(gè)有絲分裂過(guò)程中持續(xù)調(diào)節(jié)染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)。使用Scansite數(shù)據(jù)庫(kù)，我們確定蛋白激酶C（PKC）是負(fù)責(zé)KDM4A磷酸化的激酶。支持這一預(yù)測(cè)的是，KDM4A磷酸化在PKC激活劑（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；PMA）處理時(shí)增加，并被PKC抑制劑（calphostin C）強(qiáng)烈抑制。這些處理不影響KDM4A的染色質(zhì)結(jié)合能力。值得注意的是，H3R17me2a水平因PMA處理而降低，因calphostin C處理而升高。這些發(fā)現(xiàn)表明，PKC介導(dǎo)的KDM4A磷酸化使其能夠使H3R17me2a去甲基化。因此，這種磷酸化導(dǎo)致Aurkb上調(diào)和諾考達(dá)唑誘導(dǎo)的H3S10ph水平增加。我們的發(fā)現(xiàn)提出了一個(gè)引人注目的模型：KDM4A在間期作為H3K9me3和H3R2me2a的去甲基化酶發(fā)揮作用，但在有絲分裂期間被PKC磷酸化后，它使H3R17me2a去甲基化。此外，正如先前報(bào)道的，PKC在有絲分裂期間磷酸化并抑制CARM1，我們通過(guò)PKC誘導(dǎo)的CARM1條帶偏移證實(shí)了這一點(diǎn)。

Scansite數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)KDM4A的S504是潛在的PKC磷酸化位點(diǎn)，隨后通過(guò)質(zhì)譜分析得到證實(shí)。為了研究KDM4A是否通過(guò)PKCα介導(dǎo)的S504磷酸化獲得H3R17me2a的去甲基化酶活性，我們構(gòu)建了KDM4A的磷酸化模擬（S504E）和磷酸化缺陷（S504A）突變體。正如預(yù)期，使用免疫沉淀的KDM4A進(jìn)行的體外去甲基化實(shí)驗(yàn)表明，S504E突變體（而非WT或S504A）在H3R17me2a肽段上誘導(dǎo)了-28 Da的質(zhì)量偏移，表明發(fā)生了精氨酸去甲基化。此外，PMA處理或過(guò)表達(dá)PKCα-CA突變體誘導(dǎo)了KDM4A WT的磷酸化，但未誘導(dǎo)S504A突變體的磷酸化。PKC激活也未能降低過(guò)表達(dá)KDM4A S504A的細(xì)胞中的H3R17me2a水平，這與KDM4A WT相反。總之，這些結(jié)果將S504確定為KDM4A上主要的PKCα依賴(lài)性磷酸化位點(diǎn)，并證明了其在賦予H3R17me2a去甲基化酶活性中的關(guān)鍵作用。一致地，過(guò)表達(dá)KDM4A S504E降低了H3R17me2a水平，從而增加了Aurkb轉(zhuǎn)錄，而過(guò)表達(dá)S504A則沒(méi)有這種效果。KDM4A WT相對(duì)溫和的活性可能歸因于細(xì)胞環(huán)境中上游激酶的部分磷酸化。接下來(lái)，我們進(jìn)行了免疫染色以評(píng)估S504的磷酸化如何影響KDM4A的去甲基化酶活性。與WT相比，過(guò)表達(dá)S504E顯著降低了間期和有絲分裂期的H3R17me2a水平，而過(guò)表達(dá)S504A則導(dǎo)致H3R17me2a水平升高。相反，H3K9me3水平隨著S504E的過(guò)表達(dá)而增加，但不隨S504A的過(guò)表達(dá)而增加。這些結(jié)果證實(shí)了KDM4A在S504位點(diǎn)的磷酸化對(duì)其H3R17me2a去甲基化功能至關(guān)重要。

接下來(lái)，我們研究了H3K9me3水平如何隨著S504E過(guò)表達(dá)而進(jìn)一步增加。這種增加可能是由于KDM4A去甲基化酶活性喪失，抑制了H3K9me3去甲基化，或者是因?yàn)镠3R17me2a減少增強(qiáng)了Suv39h1結(jié)合，促進(jìn)了H3K9甲基化。為了闡明這些可能性，我們進(jìn)行了Suv39h1敲低實(shí)驗(yàn)和體外去甲基化實(shí)驗(yàn)。無(wú)論S504突變?nèi)绾危琒uv39h1敲低都顯著降低了H3K9me3水平。此外，KDM4A WT、S504E和S504A在體外都能有效地使H3K9me3去甲基化，這表明KDM4A S504E在保留H3K9me3去甲基化活性的同時(shí)擦除了H3R17me2a。H3R17me2a水平的降低導(dǎo)致Suv39h1招募到染色質(zhì)，隨后恢復(fù)H3K9me3水平。最后，我們證實(shí)了KDM4A在S504位點(diǎn)的磷酸化影響有絲分裂進(jìn)入。過(guò)表達(dá)S504E降低了H3R17me2a水平，增加了Aurora B水平，并恢復(fù)了H3K9me3水平，從而促進(jìn)了諾考達(dá)唑誘導(dǎo)的有絲分裂停滯。相比之下，過(guò)表達(dá)S504A則產(chǎn)生相反的效果�？傊�，我們的研究表明，在有絲分裂期間，PKCα誘導(dǎo)的KDM4A S504磷酸化不僅促進(jìn)了H3R17me2a去甲基化和Aurkb上調(diào)，而且還招募Suv39h1到染色質(zhì)，導(dǎo)致H3K9me3恢復(fù)和隨后的H3S10ph水平增加。這些連續(xù)事件促進(jìn)了完整的染色體凝縮和有絲分裂進(jìn)入。

這項(xiàng)研究通過(guò)闡明染色體凝縮過(guò)程中活躍和抑制性組蛋白標(biāo)記之間的相互作用，為調(diào)節(jié)有絲分裂的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵見(jiàn)解。具體來(lái)說(shuō)，活躍的組蛋白標(biāo)記H3R17me2a的水平在有絲分裂早期階段下降，并在后期階段恢復(fù)。這與抑制性標(biāo)記H3K9me3呈負(fù)相關(guān)，這種精細(xì)調(diào)控的過(guò)程控制了CPC的染色質(zhì)招募和有絲分裂進(jìn)程。本研究對(duì)文獻(xiàn)的一個(gè)關(guān)鍵貢獻(xiàn)是闡明了H3R17me2a水平如何下降。通過(guò)鑒定KDM3A和KDM4A作為H3R17me2a的去甲基化酶，我們確定了有絲分裂表觀遺傳調(diào)控的新參與者。KDM4A在間期使H3K9me3和H3R2me2a去甲基化；然而，在有絲分裂期間，PKCα的磷酸化改變了其底物偏好，使其能夠?qū)�H3R17me2a進(jìn)行去甲基化，并相對(duì)降低了對(duì)H3R2me2a的活性。這種磷酸化依賴(lài)的底物偏好轉(zhuǎn)變似乎是KDM4A特有的。值得注意的是，KDM3A缺乏與KDM4A S504相當(dāng)?shù)慕z氨酸/蘇氨酸殘基，并且在我們實(shí)驗(yàn)條件下未檢測(cè)到KDM3A的磷酸化依賴(lài)性變化。然而，包括PhosphoSitePlus和Scansite在內(nèi)的公共數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，KDM3A可能在多個(gè)殘基（如T308、S446、T668或Y1303）被磷酸化，特別是在G2/M期。這些觀察結(jié)果提出了KDM3A活性可能在特定環(huán)境中受磷酸化或其他翻譯后修飾（PTM）調(diào)控的可能性。闡明這些調(diào)控機(jī)制可能有助于調(diào)和體外和體內(nèi)去甲基化活性之間的差異，并有助于更全面地理解RDM的生物學(xué)作用。研究這些可能性是未來(lái)研究的重要方向，也是我們正在進(jìn)行的重點(diǎn)工作。

在G2/M期，PKCα介導(dǎo)的磷酸化抑制了CARM1依賴(lài)的H3R17甲基化，并同時(shí)促進(jìn)了KDM4A介導(dǎo)的H3R17me2a去甲基化，導(dǎo)致H3R17me2a總體水平降低。這些事件增強(qiáng)了Suv39h1向染色質(zhì)的招募以加載H3K9me3，隨后順序加載H3S10ph，從而完成染色體凝縮。在染色體凝縮涉及的眾多因子中，CPC向染色質(zhì)的招募起著關(guān)鍵作用。在G2晚期，結(jié)合在H3K9me3上的HP1將INCENP招募到著絲粒異染色質(zhì)，隨后是Aurora B介導(dǎo)的H3S10ph，這在一項(xiàng)稱(chēng)為組蛋白H3甲基-磷酸化開(kāi)關(guān)的過(guò)程中將HP1從染色體上置換。在有絲分裂早期，H3R2me2a由PRMT6介導(dǎo)，并將CPC定位在染色體臂上，之后Haspin介導(dǎo)的H3T3ph將CPC重新定位到著絲粒，促進(jìn)H3S10ph并促進(jìn)染色體凝縮。在有絲分裂晚期，H3T3ph的去磷酸化和有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白2將CPC從著絲粒重新定位到中央紡錘體，啟動(dòng)胞質(zhì)分裂。盡管額外的組蛋白修飾在有絲分裂期間發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，但其功能意義仍不清楚。

我們的研究表明，H3R17me2a水平的降低是驅(qū)動(dòng)染色體凝縮的關(guān)鍵早期事件，因?yàn)樗�與Aurora B表達(dá)增加和Suv39h1向染色質(zhì)的招募增強(qiáng)相關(guān)。H3R17me2a缺失導(dǎo)致Aurora B水平升高的分子機(jī)制仍未解決。鑒于H3R17me2a通常與轉(zhuǎn)錄活躍的染色質(zhì)相關(guān)，其減少可能通過(guò)更廣泛的染色質(zhì)變化間接影響Aurora B mRNA的表達(dá)或穩(wěn)定性，而不是通過(guò)直接的調(diào)控相互作用。重要的是，我們的發(fā)現(xiàn)將H3R17me2a減少定義為連接轉(zhuǎn)錄相關(guān)組蛋白修飾動(dòng)態(tài)與有絲分裂染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的早期染色質(zhì)轉(zhuǎn)變。這突出了組蛋白修飾之間的相互作用在協(xié)調(diào)染色體凝縮和有絲分裂進(jìn)程中的重要性，強(qiáng)調(diào)了組蛋白精氨酸甲基化在有絲分裂控制中的關(guān)鍵作用。

10T1/2、MEF和HEK293T細(xì)胞在補(bǔ)充了10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/鏈霉素的杜爾貝科改良 Eagle 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞在37°C、5% CO₂的加濕培養(yǎng)箱中維持。

列出了所使用的化學(xué)品、構(gòu)建或獲得的質(zhì)粒以及用于免疫印跡、免疫沉淀或免疫染色的抗體。

描述了細(xì)胞固定、透化、抗體孵育、共聚焦顯微鏡成像以及用于時(shí)間推移顯微鏡的GFP-H2B穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的培養(yǎng)和圖像采集方法。

描述了使用改良的低滲膨脹法進(jìn)行染色體鋪片以用于免疫染色。

描述了細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)定量、免疫沉淀、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育和ECL檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。

描述了從細(xì)胞核中酸提取組蛋白的步驟。

描述了使用免疫沉淀的蛋白（CARM1或PRMT6）與組蛋白肽段及SAM進(jìn)行的精氨酸甲基化分析，以及使用免疫沉淀的Suv39h1或重組Suv39h1蛋白與總組蛋白提取物及SAM進(jìn)行的賴(lài)氨酸甲基化分析。

描述了使用RO-3306、BI2536或諾考達(dá)唑誘導(dǎo)G2/M期停滯，使用諾考達(dá)唑處理后用MG132釋放以獲得中期停滯細(xì)胞的方法，以及使用PI染色和Alexa Fluor 488偶聯(lián)的抗H3S10ph抗體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和區(qū)分有絲分裂細(xì)胞。

描述了使用重組Aurora B蛋白與總組蛋白提取物及ATP進(jìn)行的激酶反應(yīng)。

描述了總RNA提取、cDNA合成以及使用SYBR Green染料和實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行mRNA表達(dá)定量分析的方法。

描述了分離染色質(zhì)組分的步驟，包括細(xì)胞裂解、核分離和染色質(zhì)提取。

描述了從SDS-PAGE凝膠中切取KDM4A免疫沉淀物條帶、膠內(nèi)酶解、肽段提取和質(zhì)譜分析（使用Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀和PRM模式）以鑒定KDM4A在S504位點(diǎn)的磷酸化。

描述了使用免疫沉淀的KDM4A蛋白、H3肽段、α-酮戊二酸、抗壞血酸鈉和硫酸亞鐵銨進(jìn)行的去甲基化反應(yīng)，以及使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析去甲基化產(chǎn)物。

描述了使用Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)，顯著性水平設(shè)定為p < 0.05。