淋巴細(xì)胞（B細(xì)胞或T細(xì)胞來源）惡性腫瘤在美國是第四大常見癌癥和第六大癌癥死亡原因。嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）療法在治療化療耐藥的B細(xì)胞惡性腫瘤（如靶向CD19或BCMA）方面顯示出顯著療效。CAR分子通過其單鏈可變片段（scFv）引導(dǎo)工程化的T淋巴細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原。與傳統(tǒng)的T細(xì)胞受體介導(dǎo)的識別不同，CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)不受主要組織相容性復(fù)合體（MHC）呈遞的限制，使其能夠直接識別、殺死腫瘤細(xì)胞并增殖。CAR-T療法在T細(xì)胞惡性腫瘤的早期研究中也取得了令人鼓舞的結(jié)果，自體CD7 CAR-T的完全緩解率超過90%。CD7因其在惡性白血病細(xì)胞上的獨特表達(dá)模式而成為T細(xì)胞惡性腫瘤有前景的治療靶點。它常見于未成熟T細(xì)胞惡性腫瘤（如缺乏CD5和CD1a表達(dá)的ETP-ALL），并且能在T-ALL患者治療后微小殘留病灶階段被檢測到。然而，隨著CAR-T應(yīng)用從B細(xì)胞腫瘤擴展到T細(xì)胞腫瘤，仍然存在顯著障礙。針對T細(xì)胞靶點的特定障礙在于，抗原（如CD7）通常在正常T細(xì)胞和癌細(xì)胞之間共享，導(dǎo)致CAR依賴的自相殘殺（fratricide）。B細(xì)胞和T細(xì)胞靶向共有的挑戰(zhàn)包括不良事件，如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）或繼發(fā)性惡性腫瘤，以及由于抗原逃逸或CAR-T耗竭導(dǎo)致的癌癥復(fù)發(fā)。在一個針對CD7 CAR-T療法的200名受試者的系統(tǒng)綜述中，CRS的發(fā)生率高達(dá)94%。抗原陰性復(fù)發(fā)的比例似乎也很高。在一項CD7 CAR-T的2期研究中，60名患者中有13人復(fù)發(fā)，其中5/13（38.5%）的患者CD7表達(dá)丟失。相比之下，CCR4是一種G蛋白偶聯(lián)的趨化因子受體，其特征是具有七個跨膜結(jié)構(gòu)域，可特異性識別趨化因子CCL17和CCL22。與CD7不同，CCR4在各種成熟T細(xì)胞腫瘤中高表達(dá)。隨著皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）的進(jìn)展，CD7表達(dá)丟失和CCR4表達(dá)增加是常見的觀察結(jié)果。因此，同時靶向CD7和CCR4可能緩解CD7導(dǎo)向CAR-T治療期間的抗原逃逸，并將治療適用性擴展到未成熟和成熟T細(xì)胞腫瘤。

為了應(yīng)對CAR-T療法治療T細(xì)胞惡性腫瘤的主要挑戰(zhàn)，本研究首先構(gòu)建了一種靶向CD7和CCR4的新型串聯(lián)CAR。其次，引入了一個簡單的CD7細(xì)胞去除步驟以限制自相殘殺。第三，通過過表達(dá)c-Jun改善了CAR-T的功能持久性。第四，通過包含一個截短的表皮生長因子受體（EGFRt）自殺域，使得在發(fā)生不良事件時能夠消除CAR-T細(xì)胞。最后，進(jìn)行了單細(xì)胞分析以進(jìn)一步闡明CAR-T的生物學(xué)特性，并找出潛在的治療增強途徑。

為了開發(fā)CCR4/CD7雙價CAR-T，尚不清楚外周血單核細(xì)胞（PBMCs）的單步CD7去除是否足以避免自相殘殺，或者是否需要同時去除CCR4/CD7。在PBMCs中，大多數(shù)CD3陽性細(xì)胞是CD7陽性（94.6% ± 0.68%），而19.96% ± 3.73%的CD3陽性細(xì)胞表達(dá)CCR4。經(jīng)過單步免疫磁珠CD7去除后，發(fā)現(xiàn)CD7陰性部分（以下稱為CD7N）中的大部分細(xì)胞（中位數(shù)85%）是CCR4陰性，這表明為了后續(xù)臨床開發(fā)避免細(xì)胞損失和額外成本，可能不需要進(jìn)一步去除CCR4。這些CD7N細(xì)胞在與白介素-7和白介素-15一起培養(yǎng)時表現(xiàn)出強大的擴增能力，而與白介素-2培養(yǎng)形成對比。CD7N細(xì)胞在14天的培養(yǎng)期間持續(xù)高表達(dá)CD3，但不表達(dá)CD7。通過CD3和CD28激動劑TransAct激活24小時后，CD69和CD25在CD7N細(xì)胞中的表達(dá)分別從平均4.1%（± 0.1%）和36.4%（± 0.6%）上調(diào)至70.92%（± 7.8%）和52.2%（± 11.6%）。盡管這些上調(diào)水平低于CD7去除后的CD7陽性部分以及未經(jīng)選擇的（Bulk）T細(xì)胞，但這些觀察結(jié)果表明，大多數(shù)CD7N細(xì)胞可以被CD3/CD28激動劑激活，以進(jìn)行后續(xù)的CAR載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。

為了驗證每個單獨的scFv和CAR的特異性和活性，生成了單靶向CAR-T細(xì)胞，并測試了它們對表現(xiàn)出不同CD7和CCR4表達(dá)譜的癌細(xì)胞系的活性。CAR表達(dá)通過重組人CD7蛋白和蛋白L結(jié)合來確定。盡管效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞（E:T）比率低于1:1，兩種類型的單靶向CD7N CAR-T細(xì)胞對T細(xì)胞系CCRF-CEM、ALL-SIL和HuT78均表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性。CD7亮但CCR4暗的Jurkat細(xì)胞對帶有抗CD7 CAR的T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用敏感，但對帶有抗CCR4 CAR的T細(xì)胞敏感性低得多。總的來說，這些結(jié)果證實了每種單靶向CAR的普遍活性和特異性。

在構(gòu)建雙特異性CAR之前，使用Tabula Sapiens單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集（一個涵蓋健康個體24個組織和器官的全面人類參考圖譜）評估了CCR4的安全性特征。結(jié)果表明，CCR4的表達(dá)主要局限于胸腺，但表達(dá)水平仍然很低。

為了生成串聯(lián)CAR，首先使用相同的scFv比較了CCR4/CD7與CD7/CCR4兩種構(gòu)型。與CD7/CCR4 CAR相比，CCR4/CD7串聯(lián)CAR對Jurkat、ALL-SIL和CCRF-CEM細(xì)胞表現(xiàn)出更強的細(xì)胞毒活性，而兩種構(gòu)建體對髓系對照細(xì)胞系K-562均未顯示出顯著的細(xì)胞毒性。隨后，比較了由CD7陰性T細(xì)胞生成的CD7 CAR-T細(xì)胞、CCR4 CAR-T細(xì)胞和雙特異性CCR4/CD7 CAR-T細(xì)胞對白血病細(xì)胞系Jurkat、CCRF-CEM和ALL-SIL的細(xì)胞毒性作用。結(jié)果表明，CCR4/CD7 CAR-T細(xì)胞對Jurkat細(xì)胞的殺傷活性強于單獨的CD7或CCR4 CAR-T細(xì)胞。

隨后比較了CD7N T細(xì)胞和Bulk T細(xì)胞作為CCR4/CD7 CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞。通過重組人CD7蛋白檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。值得注意的是，Bulk CAR-T中的CAR表達(dá)顯著低于CD7N CAR-T。Bulk CAR-T表現(xiàn)出擴增受損，與自相殘殺一致，而CD7N CAR-T和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的Bulk T細(xì)胞在體外培養(yǎng)8天期間表現(xiàn)出良好的增殖。在培養(yǎng)期末，CD7N CAR-T和Bulk CAR-T的細(xì)胞組成不同，與Bulk CAR-T相比，CD7N CAR-T的CD4/CD8比率更高。此外，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后，Bulk CAR-T中富集了初始T細(xì)胞，而中樞記憶T細(xì)胞在CD7N CAR-T中占主導(dǎo)。雖然CD7N CAR-T細(xì)胞中更頻繁地表達(dá)LAG-3，但在Bulk或CD7N CAR-T組中，大多數(shù)細(xì)胞不表達(dá)任何免疫檢查點受體LAG-3、PD-1或CTLA-4。與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)4小時和24小時后，分別評估了Bulk和CD7N CAR-T的脫粒和細(xì)胞因子釋放能力。兩種CAR-T群體都能夠進(jìn)行CD107脫粒和釋放細(xì)胞因子。此外，即使E:T比率低于1:1，兩種CAR-T產(chǎn)品對全部4種T系細(xì)胞系都表現(xiàn)出強大的細(xì)胞毒性，但對髓系K-562對照沒有。

使用CD7陰性復(fù)發(fā)模型進(jìn)一步驗證了雙特異性CD7N CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒效力。即使在E:T比率低于1:1的情況下，CD7N CAR-T細(xì)胞對CD7敲除的CCRF-CEM細(xì)胞或表達(dá)CCR4的K-562細(xì)胞仍保持強大的殺傷活性。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，串聯(lián)CAR對于表達(dá)CCR4和CD7水平各異的多種惡性T細(xì)胞是有效且特異的。

使用異種移植模型評估了CCR4/CD7雙特異性CD7N CAR-T的抗腫瘤療效。該模型是通過將CCRF-CEM-螢火蟲熒光素酶細(xì)胞注射到NSG小鼠尾靜脈建立的。與未治療的小鼠相比，接受CD7N CAR-T細(xì)胞治療的小鼠在腫瘤進(jìn)展延遲和生存期顯著延長方面表現(xiàn)出明顯差異。在接受CD7N CAR-T細(xì)胞治療的小鼠中，CAR-T給藥后第1天血清穿孔素水平顯著升高。這一結(jié)果證實了CD7N CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)靶向CD7高CCR4高腫瘤的強大抗腫瘤療效。

為了進(jìn)一步評估雙特異性CD7N CAR-T在體內(nèi)對另一種腫瘤細(xì)胞系的療效，選擇了Jurkat細(xì)胞系，其CD7陽性但CCR4低/陰性，模擬了治療CCR4陰性T細(xì)胞惡性腫瘤或CCR4在靶向治療后發(fā)生抗原逃逸的情況。通過尾靜脈注射Jurkat-螢火蟲熒光素酶細(xì)胞建立了第二個NSG小鼠模型。在該模型中，即使腫瘤細(xì)胞僅表達(dá)CD7而不表達(dá)CCR4，CD7N CAR-T也顯示出顯著的抗腫瘤活性。當(dāng)在CAR-T治療后的第1天和第8天測量小鼠血液中的細(xì)胞因子和細(xì)胞溶解分子時，觀察到第1天高水平的顆粒酶A和穿孔素以及第8天高水平的干擾素-γ。此外，主要器官的病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)微觀異常，表明CD7N CAR-T未在小鼠中引起組織學(xué)毒性。這些結(jié)果進(jìn)一步驗證了雙特異性CD7N CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)針對CD7高CCR4低腫瘤的強大抗腫瘤作用。

盡管CCR4/CD7雙特異性CD7N CAR-T在小鼠模型中未顯示任何組織學(xué)異常或治療相關(guān)死亡率，但在發(fā)生嚴(yán)重CRS、持續(xù)性T細(xì)胞發(fā)育不全或繼發(fā)性CAR陽性T細(xì)胞惡性腫瘤等不良事件時，安全開關(guān)是可取的。為了解決這些問題，通過雙順反子設(shè)計將EGFRt結(jié)構(gòu)域整合到CCR4/CD7雙特異性CAR構(gòu)建體中。該EGFRt系統(tǒng)允許在施用抗EGFR單克隆抗體西妥昔單抗時選擇性消除CAR-T細(xì)胞。首先使用重組人CD7蛋白確認(rèn)了CCR4/CD7雙特異性CAR構(gòu)建體（包括Bulk CAR-T-EGFRt和CD7N CAR-T-EGFRt）的表達(dá)。此外，添加EGFRt并未改變CD7N CAR-T細(xì)胞的常規(guī)表型和細(xì)胞組成，包括高的CD4/CD8比率和占主導(dǎo)地位的中樞記憶T細(xì)胞群體。CD7N CAR-T EGFRt產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子干擾素-γ水平與Bulk CAR-T-EGFRt相比有所增加。EGFRt CAR-T細(xì)胞能夠有效殺死Jurkat細(xì)胞，同時保留K-562對照細(xì)胞。即使在低至1 μg/mL的濃度下，加入西妥昔單抗24小時也會導(dǎo)致EGFRt CAR-T細(xì)胞顯著的細(xì)胞溶解。

雖然安全性至關(guān)重要，但如果能改善無耗竭的CAR-T細(xì)胞功能，CCR4/CD7雙特異性CAR的進(jìn)一步臨床開發(fā)可能會更成功。為了增強CD7N CAR-T細(xì)胞的功能持久性，測試了一種過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的CCR4/CD7 CAR構(gòu)建體。使用這個新載體，在體外測試了CD7N CAR-T的CAR表達(dá)和細(xì)胞毒性。CD4/CD8比率也未改變，并且轉(zhuǎn)導(dǎo)后中樞記憶T細(xì)胞群體仍占主導(dǎo)。值得注意的是，在構(gòu)建體中不含c-Jun的情況下，大約20-30%的CAR-T細(xì)胞呈耗竭標(biāo)志物L(fēng)AG3陽性；然而，含有c-Jun時，LAG-3陽性的CAR-T細(xì)胞頻率顯著降至10%以下。在功能上，與未過表達(dá)c-Jun的CD7N CAR-T相比，CD7N CAR-T-C-JUN細(xì)胞在體外每兩天用新鮮Jurkat細(xì)胞反復(fù)挑戰(zhàn)時，表現(xiàn)出增強的持久性。這些CD7N CAR-T-C-JUN細(xì)胞在與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)后24小時內(nèi)迅速產(chǎn)生干擾素-γ和顆粒酶B。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，當(dāng)過表達(dá)c-Jun時，CD7N CAR-T細(xì)胞的耗竭標(biāo)志物表達(dá)減少，體外功能持久性得到改善。

除了c-Jun，我們試圖探索其他可能進(jìn)一步增強CD7N CAR-T功能的分子通路。在受到Jurkat細(xì)胞系刺激后，單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因分析揭示了CD7N CAR-T、Bulk CAR-T和未轉(zhuǎn)導(dǎo)CD7N細(xì)胞中的九個不同的T細(xì)胞亞群。CD8+ T細(xì)胞簇顯示了初始和激活的組織駐留記憶/效應(yīng)記憶亞群，后者以高水平的顆粒酶A、干擾素-γ、CCL4和CCL3表達(dá)為特征。CD4+ T細(xì)胞區(qū)室包括七個簇：IL13+ T輔助2細(xì)胞；STAT1+ T輔助1細(xì)胞；FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；AQP3+ Ki-67+增殖性T細(xì)胞；LEF1+ TCF7+初始T細(xì)胞；CDC20+效應(yīng)記憶T細(xì)胞；以及IL-9+ T輔助9細(xì)胞。雖然Th1/Th2/初始細(xì)胞在Bulk CAR-T中相對豐富，而Treg/AQP3+細(xì)胞在未轉(zhuǎn)導(dǎo)CD7N細(xì)胞中富集，但CD7N CAR-T中的簇分布似乎更加平衡，所有簇都顯示出中等頻率分布。

與未轉(zhuǎn)導(dǎo)CD7N細(xì)胞相比，差異表達(dá)基因分析后的基因本體富集分析表明，CD7N CAR-T的簇1和簇6中與細(xì)胞間粘附通路相關(guān)的基因表達(dá)顯著更高，包括ICAM1、FYN和ANK3。BIRC3編碼細(xì)胞凋亡抑制蛋白2，并調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α對NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的激活，它在多個簇中高表達(dá)，同時伴有TNFAIP3、TRAF3、NFKB1A和TNFSF10的表達(dá)升高。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)暴露于癌細(xì)胞時，CD7N細(xì)胞中的CAR結(jié)合導(dǎo)致了一個以T細(xì)胞粘附、激活、存活和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)為特征的轉(zhuǎn)錄組譜，特別是涉及腫瘤壞死因子超家族。

盡管表達(dá)相同的CAR，但CD7N CAR-T細(xì)胞和Bulk CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組存在顯著差異，CD7N CAR-T在簇1、3、5和7中SOS1的表達(dá)水平顯著更高；在簇2、3和7中PTPRC的表達(dá)更高；在簇2、3和5中LGALS3的表達(dá)更高。雖然SOS1是Ras/MAPK通路的關(guān)鍵組成部分，對T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生至關(guān)重要，但PTPRC編碼的CD45和LGALS3編碼的半乳糖凝集素-3可能通過Src和Bcl-2通路傳遞信號以抑制細(xì)胞凋亡。因此，當(dāng)使用CD7N細(xì)胞而不是Bulk T細(xì)胞作為免疫效應(yīng)細(xì)胞時，Src/Ras/Bcl-2通路被更廣泛地以更高水平激活，特別是在AQP3+增殖性CD4+ T細(xì)胞中。

由于簇3 AQP3+ Ki-67+ CD4+ T細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組上與未轉(zhuǎn)導(dǎo)CD7N細(xì)胞和Bulk CAR-T細(xì)胞相比，在CD7N CAR-T組中差異最為顯著，包括特征基因如BIRC3、SOS1、PTPRC和LGALS3，我們進(jìn)一步探索了它們的生物學(xué)特性。與其他八個簇相比，簇3中的細(xì)胞表現(xiàn)出與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)升高，以及與記憶形成相關(guān)的基因表達(dá)升高。與Bulk CAR-T和未轉(zhuǎn)導(dǎo)CD7N相比，CD7N CAR-T中的簇3細(xì)胞具有最高的激活和細(xì)胞毒性基因轉(zhuǎn)錄組特征。此外，與Bulk CAR-T相比，CD7N CAR-T中增殖基因的表達(dá)水平更高，而與未轉(zhuǎn)導(dǎo)CD7N細(xì)胞相比，記憶表型在CD7N CAR-T中較少見。因此，這些數(shù)據(jù)表明，CAR信號傳導(dǎo)可能驅(qū)動CD7N CAR-T轉(zhuǎn)錄組譜的增殖和去分化。除了在CD7N CAR-T細(xì)胞中富集的SOS1外，KLF2在簇3中也顯示出相對較高的轉(zhuǎn)錄水平。與它們的CD7陽性對應(yīng)物相比，CD7N CAR-T細(xì)胞中SOS1和KLF2的表達(dá)都顯著升高。使用簇4作為分化通路的根進(jìn)行的軌跡分析證實，來自Bulk CAR-T樣本的簇3細(xì)胞主要位于偽時間軌跡的根部附近，而在CD7N CAR-T樣本中，這些細(xì)胞主要位于偽時間的末端，同時富集了與有絲分裂和激活相關(guān)的基因，以及SOS1和KLF2表達(dá)的增加。由于KLF2與保持干細(xì)胞樣T細(xì)胞特性和抑制終末功能障礙有關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)表明，雙特異性CAR信號傳導(dǎo)可能緩解CD7N CAR-T產(chǎn)品中與耗竭相關(guān)的表型，這與體外實驗觀察到的表型一致。

為了研究簇3細(xì)胞在CD7N CAR-T和Bulk CAR-T群體中的簇間通訊，進(jìn)行了配體-受體相互作用分析。與CD7N CAR-T相比，Bulk CAR-T中的簇3細(xì)胞具有更廣泛的簇間通訊和配體-受體相互作用。相比之下，CD7N CAR-T中的簇3細(xì)胞主要通過PPIA-BSG與簇5和簇6相互作用，以及通過MIF-CD74/CXCR4與簇1和簇2相互作用。值得注意的是，簇3細(xì)胞通過腫瘤壞死因子超家族與除簇5之外的所有其他簇進(jìn)行廣泛的配體-受體相互作用。相比之下，Bulk CAR-T的簇3上的半乳糖凝集素-9獨特地與多個其他簇上的CD45、CD44和P4HB相互作用，這可能有助于Bulk CAR-T亞群之間的抑制性信號傳導(dǎo)。

為了克服CAR-T療法治療T細(xì)胞惡性腫瘤中常見的自相殘殺、T細(xì)胞耗竭、抗原逃逸和持續(xù)性T淋巴細(xì)胞減少癥等挑戰(zhàn)，本研究首先建立了使用CD7陰性細(xì)胞靶向CCR4和CD7的雙特異性CAR-T細(xì)胞。將轉(zhuǎn)錄因子c-Jun整合到CAR構(gòu)建體中賦予了抵抗耗竭的能力，而過表達(dá)EGFRt則作為安全開關(guān)，能夠在CAR-T細(xì)胞持續(xù)存在期間發(fā)生不良事件時選擇性清除它們。雖然單靶點CD7 CAR和CCR4 CAR在之前的臨床前研究中已有探索，但本研究首次開發(fā)了同時靶向CCR4和CD7的雙特異性CAR。CD7因其在超過95%的T淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤和一部分外周T細(xì)胞淋巴瘤中的高表面表達(dá)，已成為未成熟T細(xì)胞惡性腫瘤最常見的CAR靶點。然而，大多數(shù)成熟T細(xì)胞腫瘤是CD7陰性的，這曾被用于診斷目的。將CCR4納入雙價CAR構(gòu)建體是為了覆蓋成熟T細(xì)胞惡性腫瘤，并減輕隨著時間的推移在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中觀察到的CD7陰性進(jìn)展的風(fēng)險。先前的臨床前研究表明，CCR4單靶向CAR對成熟的人類T細(xì)胞淋巴瘤具有活性。在本研究中，CCR4和CD7 CAR在具有可變靶點表達(dá)譜的一系列T細(xì)胞惡性腫瘤中，對于單靶向和雙靶向均具有活性，包括僅低水平表達(dá)CD7和CCR4的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤HuT78。除了T細(xì)胞腫瘤外，CD7也在一些髓系惡性腫瘤中表達(dá)，例如30%的急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征，這與不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步嘗試將此雙特異性CAR應(yīng)用于髓系惡性腫瘤值得研究。

抗自相殘殺的CD7 CAR-T已經(jīng)通過基因組編輯、表面下調(diào)、瞬時CAR信號抑制或使用CD7陰性效應(yīng)細(xì)胞等方法開發(fā)出來。使用CCR4/CD7雙特異性CAR的一個主要擔(dān)憂是它是否會加劇CAR-T細(xì)胞的自相殘殺，導(dǎo)致制造和治療失敗，因為只有一小部分血液T細(xì)胞是CCR4/CD7雙陰性，并且僅CD7基因編輯/表面下調(diào)無法避免CCR4介導(dǎo)的CAR-T自相殘殺。此外，使用CRISPR/Cas9方法敲除CD7受到意外基因改變、基因編輯嵌合性、監(jiān)管障礙、制造復(fù)雜性和成本的限制。相比之下，本研究的CD7N選擇過程是非基因毒性的，經(jīng)過簡單的僅需兩小時的CD7去除程序后，可便捷地獲得超過95%純度的CD7陰性細(xì)胞。這些CD7N細(xì)胞在含有白介素-7和白介素-15的培養(yǎng)體系中增殖良好，在雙價CAR載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后8天內(nèi)實現(xiàn)了超過10倍的擴增，與未經(jīng)選擇的起始細(xì)胞相比，自相殘殺最小。

CAR-T治療后的不良事件很常見；有些可能危及生命，包括嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放綜合征、T淋巴細(xì)胞減少癥或第二惡性腫瘤。雖然由于自然存在的CD7陰性T細(xì)胞的恢復(fù)，在大多數(shù)CD7 CAR-T接受者中未觀察到完全的T細(xì)胞發(fā)育不全，但使用CCR4/CD7雙特異性CAR可能會加劇免疫缺陷的風(fēng)險。器官（如肺）中可能表達(dá)低水平的CCR4，導(dǎo)致靶上脫瘤的不良事件。在這方面，本研究的CCR4 CAR-T細(xì)胞對從健康小鼠獲得的CCR4陽性T細(xì)胞具有細(xì)胞毒性；然而，在小鼠模型中未觀察到肺毒性。對于CD19 CAR-T，先前的研究表明，某些復(fù)發(fā)可歸因于表位掩蔽，即當(dāng)CAR基因在T細(xì)胞制造過程中無意中被引入白血病B細(xì)胞時，導(dǎo)致CAR與白血病細(xì)胞表面的CD19表位發(fā)生順式相互作用。對于T系白血病，這種不良事件不容易通過在轉(zhuǎn)導(dǎo)前富集T細(xì)胞的策略來預(yù)防，因為白血病細(xì)胞可能表達(dá)相同的T細(xì)胞抗原。CAR-T細(xì)胞中過表達(dá)c-Jun可能會進(jìn)一步增加白血病增殖的風(fēng)險。考慮到這些限制，本研究測試了在發(fā)生此類不良事件時，通過將EGFRt整合到雙特異性CAR載體設(shè)計中來消除CAR-T細(xì)胞的可行性。雖然未觀察到CCR4/CD7 CAR-T的表型和功能發(fā)生改變，但該細(xì)胞可被市售抗體西妥昔單抗以低至1 μg/mL的濃度輕易裂解，顯著低于西妥昔單抗接受者血漿中的通常谷濃度。在接受重復(fù)每周劑量的西妥昔單抗治療后約100天，曾報道過罕見的嚴(yán)重肺部毒性病例。對于本研究的雙特異性CAR-T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)即使在低濃度下短至24小時的西妥昔單抗暴露也可導(dǎo)致三分之一的CAR-T細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞溶解。因此，消除CAR-T所需的相對較短的西妥昔單抗暴露時間可能毒性較小。

鑒于CAR-T可以通過安全開關(guān)關(guān)閉，我們試圖確定持續(xù)激活原癌基因是否能減少CAR-T耗竭，這是癌癥復(fù)發(fā)的另一個常見機制。在這方面，c-Jun和堿性亮氨酸拉鏈ATF樣轉(zhuǎn)錄因子可能通過取代激活蛋白-1和干擾素調(diào)節(jié)因子復(fù)合物中的其他抑制性家族成員來誘導(dǎo)抗耗竭，這些家族成員通常驅(qū)動T細(xì)胞走向耗竭和終末分化。之前已經(jīng)證明，在Bulk CAR-T細(xì)胞中過表達(dá)c-Jun可以改善抗腫瘤效力并促進(jìn)細(xì)胞存活；然而，其對CD7N細(xì)胞的影響尚不確定，因為CD7陰性T細(xì)胞代表了一個更終末分化的群體，與CD7陽性T細(xì)胞相比，表現(xiàn)出降低的激活和增殖潛力。確實，本研究在此證明了CCR4/CD7雙特異性CD7N CAR-T在體外反復(fù)挑戰(zhàn)白血病細(xì)胞后表現(xiàn)出功能耗竭；然而，在這些CAR-T細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)c-Jun改善了它們的功能持久性。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析顯示，CD7N CAR-T細(xì)胞主要由CD4+ T細(xì)胞組成，并且在腫瘤暴露后發(fā)生轉(zhuǎn)錄組變化。在與細(xì)胞粘附、激活、存活和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)相關(guān)的通路中觀察到顯著的基因表達(dá)改變。一個獨特的AQP3+細(xì)胞亞群尤其值得注意，它具有廣泛激活的Src/Ras/ERK/Bcl-2通路的轉(zhuǎn)錄組特征，以及涉及PPIA/MIF和腫瘤壞死因子超家族的簇間配體-受體相互作用。SOS1和KLF2被鑒定為在CD7N CAR-T細(xì)胞中上調(diào)最顯著和差異最大的基因。SOS1調(diào)節(jié)PIK3CD，其功能獲得性突變已被證明可以增強CAR-T信號傳導(dǎo)、細(xì)胞因子產(chǎn)生和白血病細(xì)胞殺傷。最近，另一項研究表明，KLF2可以促進(jìn)效應(yīng)性CAR-T細(xì)胞的分化并防止終末耗竭，從而增強CAR-T療效。總的來說，這些數(shù)據(jù)提出了調(diào)控SOS1和KLF2可能成為增強CAR-T細(xì)胞療效的潛在途徑的可能性。

雖然當(dāng)前研究利用異種移植模型證明了CD7N雙特異性CAR-T細(xì)胞在體外和體內(nèi)的有效性和安全性，但必須承認(rèn)幾個局限性。在臨床轉(zhuǎn)化之前，需要在患者來源的異種移植物等模型中進(jìn)行進(jìn)一步驗證。盡管本研究中觀察到c-Jun過表達(dá)可以維持CAR-T細(xì)胞的功能持久性并減少體外反復(fù)腫瘤挑戰(zhàn)后的耗竭，但它是否能在體內(nèi)維持CAR-T細(xì)胞的持久性仍有待確定。未來的體內(nèi)研究需要使用整合了c-Jun和EGFRt的CAR構(gòu)建體，以最終評估長期功能持久性、晚期不良事件以及西妥昔單抗介導(dǎo)的安全開關(guān)的永久性。雖然配體-受體相互作用分析揭示了PPIA/MIF在暴露于癌細(xì)胞后參與CAR-T的簇間通訊，但大多數(shù)相關(guān)的配體-受體相互作用將與T細(xì)胞區(qū)室外的細(xì)胞發(fā)生，這強調(diào)了在未來分析中進(jìn)行更廣泛研究的重要性。盡管在CD7N CAR-T細(xì)胞中觀察到了SOS1和KLF2