以抗PD-1為代表的免疫檢查點抑制劑（ICIs）已徹底改變了晚期黑色素瘤的治療格局，但其所引發(fā)的免疫相關不良事件（irAEs）已成為影響患者治療與生活質量的重要臨床挑戰(zhàn)。irAEs的病理生理機制尚不完全清楚，尤其在肢端型黑色素瘤這一亞型中。針對irAEs的預測性生物標志物仍很缺乏。外周血單核細胞（PBMCs）作為系統性免疫反應的微創(chuàng)監(jiān)測窗口，是探索與療效和毒性相關循環(huán)標志物的寶貴資源。本研究旨在利用單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術，全面刻畫接受抗PD-1單藥（主要為特瑞普利單抗，toripalimab）治療的肢端型黑色素瘤患者中，與irAEs發(fā)生相關的免疫特征。

本研究納入了八名黑色素瘤患者：三名在ICI治療后發(fā)生irAEs（AE組），三名治療后未發(fā)生irAEs（NAE組），以及兩名未接受治療的對照患者（UNT組）。觀察到的具體irAEs包括惡心、嘔吐、疲勞（使用帕博利珠單抗pembrolizumab后）、皮疹和白癜風（使用特瑞普利單抗后）以及紅斑性丘疹（使用特瑞普利單抗后）。NAE組患者均接受特瑞普利單抗治療。

對總計54，793個高質量PBMCs進行單細胞分析。與NAE組和UNT組相比，AE組CD4⁺T細胞頻率降低，而CD8⁺T細胞頻率增加。NAE組則表現出更高的NK細胞頻率和更低的單核細胞頻率。將數據標準化至總T細胞后，AE組的CD8⁺T細胞頻率最高，CD4⁺T細胞頻率最低。與治療前相比，治療后（AE和NAE組）T細胞中PDCD1（PD-1）表達降低，而CTLA4， TIGIT， LAG3， HAVCR2（TIM-3）及轉錄因子TOX表達增加，且這些效應在AE組中更為明顯。總之，抗PD-1治療與PBMC內T細胞亞群平衡的改變相關，表現為CD8⁺T細胞增加和CD4⁺T細胞減少，這一轉變在AE組最為顯著。

對T細胞進行亞分析，鑒定出11個不同的亞群：三個CD4⁺T細胞亞群、三個CD8⁺T細胞亞群、調節(jié)性T細胞（Tregs）、γδ T細胞（gdT）、黏膜相關恒定T細胞（MAIT）、增殖性T細胞及其他未指定T細胞。通過經典標志物，將CD8 T_2定義為過渡性/效應記憶樣CD8⁺T細胞（表達GZMK），CD8 T_3定義為終末效應/細胞毒性CD8⁺T細胞（表達CX3CR1， GZMB等）。分析顯示，AE組處于G2/M期的細胞比例略高，增殖性T細胞的頻率也較NAE組增加。與治療前和NAE組相比，抗PD-1治療后AE組中CD8 T_3（細胞毒性）細胞的頻率增加，而CD8 T_2細胞的頻率降低。CD8 T_2與CD8 T_3細胞的比率在AE組中相比UNT組大幅下降。這些結果表明，T細胞向細胞毒性和增殖性表型增強的傾向與AE組患者發(fā)生irAEs存在機制上的聯系。

差異表達基因和基因集變異分析（GSVA）表明，CD8 T_3（細胞毒性）簇富含GNLY， FGFBP2， GZMB， NKG7等細胞毒性標志物，其細胞毒性評分也最高。CD8 T_2（過渡性）簇以GZMK， CCL4， CCL5為標志，其GZMK⁺過渡性基因特征評分最高，而細胞毒性評分較低。抗PD-1治療增強了細胞毒性和耗竭相關通路的表達，同時降低了與GZMK⁺過渡性基因、幼稚細胞標志物和高PD-1表達相關的通路表達。患者年齡與GZMK表達或GSVA評分無顯著關聯。基因本體（GO）分析進一步揭示，CD8 T_2簇在T細胞活化和分化相關通路中富集，而CD8 T_3簇主要在細胞毒性相關通路中富集。

對CD8⁺T細胞的進一步分析將其分為幼稚、過渡性（GZMK⁺）、細胞毒性1、細胞毒性2和增殖性五個簇。小提琴圖顯示，過渡性（GZMK⁺）簇代表了一個中間狀態(tài)，表現出中等的幼稚和細胞毒性特征評分，而其GZMK過渡性特征評分達到峰值。抗PD-1治療后，AE組的細胞毒性CD8⁺T細胞顯著增加，而幼稚和過渡性（GZMK⁺）細胞相應減少。此外，過渡性與細胞毒性T細胞的比率在AE組相比UNT組顯著降低。相反，NAE組的幼稚CD8⁺T細胞比例略高，細胞毒性細胞比例與UNT組相當。AE組還表現出相比NAE和UNT組更高的增殖能力。GO分析顯示，AE組在細胞殺傷相關通路中特異性富集，而UNT和NAE組則更多與代謝和細胞活化通路相關。總之，這些結果進一步表明，抗PD-1治療后，AE組細胞毒性CD8⁺T細胞顯著增加，并伴有過渡性與細胞毒性CD8⁺T細胞比率降低。

軌跡分析揭示了CD8⁺T細胞從幼稚狀態(tài)出發(fā)的兩條主要分化路徑：一條導向過渡性CD8⁺T細胞，另一條導向終末細胞毒性CD8⁺T細胞。過渡性CD8⁺T細胞主要位于該軌跡的中點，表明其是在完全分化為細胞毒性表型之前的關鍵過渡階段。隨著偽時間（pseudotime）的推移，幼稚和細胞毒性標志物在軌跡兩端分別達到峰值，而GZMK， CMC1和DUSP2等標志物則在過渡階段達到峰值，提示細胞功能的逐步轉變。分支表達分析建模（BEAM）顯示，向細胞毒性CD8⁺T細胞分化的軌跡特征在于NKG7， GZMB， GNLY， PRF1等細胞介導的細胞毒性相關基因的富集；而向過渡性CD8⁺T細胞分化的軌跡則與MALAT1， NEAT1， GZMK等基因的富集相關，暗示其為功能轉換準備的細胞狀態(tài)。這些發(fā)現表明，過渡性CD8⁺T細胞可能作為一種多功能的中介，在抗PD-1治療后調節(jié)免疫反應，影響受控免疫反應與攻擊性細胞毒性攻擊之間的平衡。

本研究通過對接受抗PD-1治療的肢端型黑色素瘤患者的PBMCs進行scRNA-seq分析，揭示了與irAEs相關的獨特免疫特征。與文獻一致，研究發(fā)現AE組患者總CD4⁺T細胞減少，總CD8⁺T細胞和單核細胞增加。深入分析顯示，AE組患者表現出細胞毒性CD8⁺T細胞增加、GZMK⁺過渡性CD8⁺T細胞減少以及增殖性細胞升高。本研究并未發(fā)現先前報道的irAEs患者中MAIT和Tregs減少的現象。高表達GZMB， PRF1， GNLY的細胞毒性CD8⁺T細胞具有強大的效應功能，這可能有利于強效抗腫瘤活性，但也可能暗示其導致脫靶組織損傷從而引發(fā)irAEs的傾向。標記有GZMK表達的過渡性CD8⁺T細胞，似乎代表了從幼稚狀態(tài)到完全細胞毒性狀態(tài)之間的中間階段。這些細胞富集GZMK⁺過渡性標志物，其細胞毒性GSVA評分較低，表明其細胞毒性能力更為克制。這種克制可能有助于緩和激進的免疫反應，從而在有效腫瘤控制和減輕治療相關毒性之間取得平衡。它們在AE患者中的耗竭可能破壞這種平衡，有利于不受控制的細胞毒性活動和組織損傷。軌跡分析證實，GZMK⁺T細胞位于幼稚到細胞毒性分化連續(xù)體的過渡狀態(tài)。這突顯了過渡性與細胞毒性CD8⁺T細胞比率作為irAE風險的探索性候選生物標志物的潛力。此外，AE組患者增殖性T細胞比例增加，可能放大了具有更高反應性的克隆，這與irAEs發(fā)生率增加相符。本研究也存在局限性，例如樣本量較小。未來工作應通過TCR克隆性測定和抗原特異性篩選來確定irAEs中的細胞毒性CD8⁺T細胞是自身反應性的還是腫瘤特異性的。同時，探索GZMK在過渡性細胞功能中作用的機制研究，可能為解耦療效與毒性提供新的治療靶點。

總而言之，本研究強調了在最大化ICIs治療效果的同時最小化其不良反應所需的微妙平衡。通過闡明細胞毒性、過渡性和增殖性CD8⁺T細胞在irAE發(fā)生中的作用，為理解肢端型黑色素瘤患者抗PD-1治療期間的免疫失調提供了新的見解。描繪這些細胞轉變及其功能后果，使我們更接近預測、預防和管理黑色素瘤患者irAEs的個體化策略。