鋅是一種必需的微量元素，構成約10%的人類蛋白質組的結構成分，在300多種酶中作為催化組分，并在約750個轉錄因子中作為結構成分。因此，鋅在生長、性成熟、新陳代謝和免疫中扮演重要角色。全球近五分之一的人口面臨鋅缺乏風險，這種情況在受糧食不安全和/或慢性病影響的脆弱人群中尤為突出。免疫系統發育和穩態受損是嚴重鋅缺乏最明顯的癥狀之一。因此，鋅缺乏與反復感染相關，源于免疫細胞成熟和功能的主要缺陷。

鋅缺乏在慢性肝病(CLD)患者中尤其常見，這是由于鋅吸收不良以及肝臟白蛋白(血液中鋅的主要載體)產生減少導致鋅滯留受損所致。因此，在肝硬化患者中，血清鋅的正常化已被證明可顯著改善肝功能標志物(例如膽紅素、堿性磷酸酶和白蛋白)，同時提高生存率并降低肝細胞癌(HCC)的發生率。酗酒可通過促進尿鋅排泄增加和減少腸道吸收而加劇鋅缺乏，這與肝病無關。酒精性肝炎(AH)是一種由過量飲酒引起的嚴重病癥，其特征是黃疸快速發作，以及包括膽紅素和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)在內的肝臟應激標志物升高。由于在數月到數年內過量飲酒，加上這些患者常見的肝功能不全，AH成為血液和肝臟中鋅缺乏最嚴重的肝病之一。

由于采樣的便捷性和臨床診斷的需要，鋅幾乎完全從血清中量化，而血清鋅僅占全身總鋅的0.1%。血清鋅也不能很好地反映組織鋅濃度，而組織鋅濃度可能受到鋅缺乏的不成比例的影響。為了了解鋅缺乏在肝病病理學中的作用，準確評估病變組織內的鋅濃度至關重要。為了解決這個問題，我們假設組織內的鋅狀態可以根據鋅刺激基因(ZSG)的表達來估計。利用公開可用的數據集，我們生成并驗證了一個基因特征評分，用于估計慢性肝病(特別是AH)患者肝組織內的鋅含量。該轉錄組鋅特征評分被用于查詢大型AH肝組織轉錄組數據集，以更好地了解肝臟鋅缺乏如何促進AH的發病機制。生物信息學分析表明，鋅是肝臟急性期反應的主要驅動因素。由于巨噬細胞和肝細胞是急性期反應的主要驅動者，我們使用原代肝細胞和巨噬細胞培養物在體外驗證了鋅的作用。這些數據表明，AH中的鋅缺乏會特異性抑制巨噬細胞對感染的急性期反應，并可能通過使患者易受危及生命的感染而顯著惡化長期結果。

查詢了美國國家生物技術信息中心(NCBI)基因表達綜合數據庫(GEO)和PubMed，使用術語鋅、TPEN (N,N,N'N'-四(2-吡啶甲基)-乙二胺)、處理、耗竭、補充和缺乏。共確定了10個鋅處理和3個鋅耗竭數據集，根據數據集質量和可用性，分別分析了其中9個和2個。使用R統計環境分析數據集，如補充圖S1所述。簡而言之，根據需要對芯片表達數據進行對數轉換和分位數歸一化，然后基于對數表達數據進行數據集特異性過濾。來自RNA測序平臺的基因計數數據經過數據集特異性過濾，然后使用EdgeR進行歸一化和離散度估計。使用經驗貝葉斯差異表達統計(eBayes)分析芯片數據，使用廣義線性模型擬然F檢驗(glmQLF)分析測序數據，并使用Benjamini-Hochberg方法進行多重檢驗校正以控制錯誤發現率(FDR)，正如我們之前所做的那樣。另外還使用了Palmer等人和Tuomela等人進行的差異基因表達分析。在所有包含多于一種細胞類型的數據集(GSE39316, GSE39330)中，分別檢查了細胞類型，除了數據集GSE25167，其中將HaCat和Sk Mel-28細胞轉錄組(各n=1)合并，以便在模擬和鋅處理樣本之間進行統計學比較。ZSGs定義為鋅處理后基因轉錄顯著(p<0.05)誘導≥1.5倍，或者相反，鋅耗竭后降低≤1.5倍。

如上所述分析了AH轉錄組數據集GSE28619、GSE143318、GSE155907、GSE142530和GSE94417。使用ComBat在分位數歸一化數據上合并并校正了數據集GSE94397、GSE94399和GSE103580的批次效應。美國國立衛生研究院(項目#31612)批準了訪問DbGaP研究phs003112.v1.p1的權限。對于DbGaP研究，使用SRAtools(v3.0.0)下載了fastq文件和樣本元數據，使用FastQC(Babraham Bioinformatics)確定文庫測序質量。使用Trim Galore! (Babraham Bioinformatics)進行了Illumina適配子序列和低質量讀段修整(如果讀段對<20個堿基對則移除)。使用STAR 52將讀段與人類基因組hg38比對，以ENSEMBL基因注釋為指導。使用HTSeq生成對應于ENSEMBL基因注釋的讀段計數數據。生物信息學處理和分析流程已添加到https://github.com/Scotch25/ZincALDManuscript。

從11個數據集中整理了鋅刺激基因表達，其中ZSGs定義為上調≥1.5倍，p<0.05。在≥5/11個數據集中被鋅上調的基因被納入初步的鋅特征譜。選擇5個數據集作為臨界值(而不是代表所檢查數據集>50%的6個)，以解釋一些數據集中缺乏ZSG表達數據的情況。

從Westmead醫院和Westmead醫學研究所的健康志愿者處收集血液樣本。分別在Westmead醫院和Blacktown醫院的肝細胞癌切除術或減肥手術期間獲取肝組織。所有工作均根據《赫爾辛基宣言》和《伊斯坦布爾宣言》進行。獲得了悉尼西部地區衛生服務和悉尼大學的倫理批準。所有受試者均獲得了知情同意。

使用Ficoll Paque Plus密度梯度分離法分離外周血單核細胞(PBMCs)。PBMCs在含有10%胎牛血清的RPMI培養基中于37°C、5% CO₂條件下培養。為了生成巨噬細胞，使用CD14微珠和AutoMacs Pre Separator從PBMCs中分離出5 x 10⁵個單核細胞。細胞在含有10%胎牛血清和50 ng/mL M-CSF的RPMI培養基中分化7天，第3天更換培養基。

從肝活檢/切除術收集的人類肝組織中生成基于肝臟類器官的細胞單層。將組織切碎并用膠原酶IV(1mg/ml)在37°C下消化30分鐘，然后將細胞通過100 μm細胞篩，以50 x g離心5分鐘。收集代表濃縮肝細胞的細胞沉淀，將細胞重懸于擴增培養基中，并重復50 x g離心步驟兩次。將肝細胞重懸于Matrigel中，并加入類器官擴增培養基。在肝臟類器官充分擴增后(傳代后3-5天，類器官仍在積極擴增但相對較小時)，使用冷PBS將類器官從基質膠中取出，然后用TrypLE在37°C下消化3分鐘。將單細胞懸液加入膠原包被的48孔板中，使用擴增培養基，直至細胞達到80-90%匯合。在鋅補充/耗竭培養基處理前3天，將擴增培養基更換為分化培養基。類器官培養在37°C、5% CO₂條件下生長。

Huh-7細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中于37°C、5% CO₂條件下培養。所有實驗處理均在約80%匯合度時進行。

如前所述進行培養基的鋅耗竭。簡而言之，將培養基與S100A12鋅結合樹脂在室溫下以80 μl樹脂:1 mL培養基的比例振蕩孵育過夜。以400 x g離心5分鐘沉淀樹脂，并立即取出培養基供使用。去除培養基并用PBS洗滌一次后，將鋅耗竭(ZnDep)培養基加入細胞。對于所有鋅處理和補充實驗，向培養基中加入50 μM ZnSO₄。

使用Favorgen總RNA試劑盒提取RNA，并使用MMLV逆轉錄酶合成cDNA。使用VIC和FAM偶聯的Taqman探針或基因特異性引物和TaqMan Fast Advanced MasterMix測量基因表達。通過ΔCt方法將基因歸一化為18s核糖體RNA或看家基因36B4或UBC。

收集前，用PBS中的5 μM鋅熒光探針Zinpyr-1在37°C下處理細胞30分鐘。接下來用膠原酶處理類器官和Huh-7細胞以生成流式分析所需的單細胞懸液。用活性染料FVS700染色細胞，并使用BD Bioscience LSR Fortessa細胞分析儀或Miltenyi Biotec MACSQuant Analyser 10進行檢查。為了檢查單個PBMC群體，用FcR封閉試劑處理PBMCs，然后用以下組合標記：BUV395 CD3、PE-Cy7 CD56、BV711 CD14、APC-Cy7 CD19和PE-CF594 CD11c。使用FlowJo v10.8.1分析流式細胞術數據。

在GraphPad Prism Version 8中分析數據并生成圖形。使用的統計檢驗基于數據的正態性(參數與非參數)，并在圖例中與生物學重復次數一起注明。所有體外實驗均使用至少2個實驗重復和2個技術重復進行，樣本量已包含在圖例中。使用ConsensusPath-DB和基因集富集分析(GSEA)軟件進行功能注釋。使用過度表達分析來定義與上調(>1.5倍)基因集相關的生物學過程和通路。使用Broad Institute的Morpheus軟件生成基因表達熱圖。

為了鑒定被鋅一致且強效誘導的基因，我們搜索了公開可用的、進行了鋅處理的轉錄組數據集。在確定的十項研究中，有十一個鋅處理數據集適合進行統計分析。分析的轉錄組在使用的芯片/測序技術、細胞類型、鋅處理(鋅鹽和鋅納米顆粒)、鋅濃度(25-250 μM)和處理持續時間(4-24 h)方面存在異質性。因此，顯著上調(誘導≥1.5倍，p<0.05)的ZSGs數量從<10到>1000不等。

首先選擇在≥5/11個數據集中被鑒定的顯著上調的ZSGs，以生成初步的轉錄組鋅特征譜。總共鑒定出18個轉錄本，其中以屬于金屬硫蛋白(MT)基因家族的基因為主。此外，一組負責DNA損傷和應激反應的基因(例如HSPA6, DDIT3)被上調，表明一些鋅處理實驗引發了顯著的細胞應激。事實上，當檢查所有數據集中ZSG的誘導情況時，只有那些使用高于150 μM的高鋅濃度(例如Palmer等人，GSE60159)或鋅離子載體(GSE6960)的實驗刺激了轉錄組應激反應。使用ConsensusPath-DB進行的通路富集分析證實了數據集特異性的轉錄反應。高鋅濃度數據集富集了細胞應激通路，而GSE99435轉錄組富集了金屬離子反應通路，應激通路富集最少。由于體內血清鋅很少超過20 μM，因此不太可能刺激此處鑒定的細胞應激反應。因此，所有與細胞應激相關的轉錄本均從初步的鋅特征譜中移除。即使在缺乏引發鋅介導的細胞應激的數據集的情況下，剩余的九個ZSGs仍然被高度上調。

接下來，我們使用在線工具PScan檢查了ZSG啟動子，以識別可能表明鋅上調的過度表達的轉錄因子結合基序。我們輸入了4個ZSGs列表，包括九基因鋅特征譜，以及代表存在于≥5個數據集(n=18)、≥4個數據集(n=57)和≥3個數據集(n=119)中的ZSGs列表。金屬轉錄因子1(MTF-1)的結合基序在所有基因列表中均顯著富集，在九基因特征譜的每一個啟動子序列中都存在結合位點。MTF-1直接被鋅激活，并且是MT表達的主要驅動因素，正如敲低研究所證明的那樣。

為了驗證鋅耗竭后的九基因轉錄鋅特征譜，我們檢查了兩個使用不同鋅去除方法的數據集中的ZSG表達：基于S100A12樹脂的鋅耗竭(GSE108923)或TPEN介導的離子螯合(GSE99204)。證實了我們的假設，在HEK293T細胞中，所有測量的鋅特征基因在響應S100A12樹脂基的鋅螯合時均下調，并在添加鋅后受到刺激。在TPEN處理的人角質形成細胞中，除了MT1F和SLC30A1被上調外，鋅特征基因轉錄本顯著減少。在兩個數據集中，細胞應激標志物表達(例如，DDIT3, DNAJB1)因鋅去除而增加，表明它們確實不是真正的ZSGs。

進行了轉錄組的功能注釋，以更好地了解鋅剝奪在這些數據集中的影響。S100A12介導的鋅去除具有高度特異性，并且基于轉錄反應，對細胞過程的破壞最小。另一方面，TPEN離子螯合(對鋅不具特異性)抑制了許多穩態通路，包括轉錄、翻譯、新陳代謝和細胞周期。

為了解決ZSGs調節不一致(GSE99204)和缺乏MT表達數據(GSE108923)的問題，我們在體外進行了鋅處理和耗竭實驗。為了模擬主要的肝臟細胞群體，使用了三種體外模型：Huh-7肝癌細胞和原代肝臟類器官單層用于模擬肝細胞，外周血單核細胞(PBMCs)用于模擬常駐和浸潤的免疫細胞。所有細胞均在模擬處理或S100A12樹脂鋅耗竭(ZnD)培養基中培養24小時±補充50 μM ZnSO₄。使用鋅熒光探針Zinpyr-1量化細胞內鋅，并通過qPCR量化ZSGs。與未經處理的Huh-7細胞相比，鋅耗竭和鋅處理分別導致細胞內鋅含量顯著降低和增加，如Zinpyr-1熒光所測量。與細胞內鋅含量一致，除SLC30A1外，所有ZSGs在鋅耗竭后均顯著下調，并在鋅處理后顯著誘導。對鋅濃度反應最強的基因(例如，MT1E, MT1G)通常在未經處理的Huh-7細胞中表達最高。肝臟類器官細胞內鋅受到鋅耗竭和處理的調節，但程度遠低于Huh-7細胞。類似地，肝臟類器官ZSG表達受鋅耗竭影響較小，但對鋅處理高度敏感。類器官ZSG表達也獨特，其中SLC30A1顯示出最高的相對表達，而MT1G低于檢測限。

在鋅耗竭和補充后，還通過流式細胞術檢查了PBMC群體以評估細胞內鋅含量。未經處理的樹突狀細胞(DCs)和單核細胞與淋巴細胞群體相比，擁有更大的細胞內鋅池，如更高的Zinpyr-1熒光所示。有趣的是，只有淋巴樣細胞受鋅耗竭顯著影響，顯示Zinpyr-1熒光降低(B細胞和NK細胞，p<0.05)。除T細胞外，所有細胞群體在響應鋅處理時均表現出Zinpyr-1熒光增加，單核細胞與其他細胞相比表現出強烈的鋅內流。PBMC的MT1A、MT1E、MT1G和MT1M被鋅刺激，而除MT1M和SLC30A1外，所有基因在鋅耗竭培養基中均顯著降低。基線ZSG表達顯示MT1M表達非常低，這或許反映了鋅處理后的強烈誘導。

為了評估ZSGs的鋅特異性誘導，除了鋅(Zn²⁺)之外，還用含有二價陽離子鈣(Ca²⁺)、銅(Cu²⁺)錳(Mn²⁺)、鎂(Mg²⁺)和鐵(Fe²⁺)的50 μM金屬鹽處理了PBMCs。除了鋅，銅處理也顯示出多個ZSGs的顯著誘導。

為了比較不同慢性肝病之間的肝臟鋅狀態，查詢了包含健康和病變肝組織數據的轉錄組數據集。為了簡化分析，使用九個驗證過的ZSGs的平均歸一化對數每百萬計數(CPM，RNA測序平臺)或對數強度(芯片平臺)生成了鋅特征評分。所有9個ZSGs在鋅特征評分中被賦予相同的權重，以便于跨數據集和組織使用鋅特征譜，因為在不同的數據集和組織中，單個ZSGs的表達差異顯著，如圖所示。從慢性乙型肝炎病毒(CHB, n=3)和慢性丙型肝炎病毒(CHC, n=1)感染、脂肪變性(n=5)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH, n=5)、肝細胞癌(HCC, n=4)、肝硬化(n=5)和酒精相關肝病(ALD, n=4)的肝組織中獲取ZSG表達數據，并與每個數據集中可用的健康對照進行比較，以生成每個基因的對數2倍變化(FC)。雖然慢性病毒感染和脂肪變性不影響ZSG表達，但ZSGs在響應慢性炎癥(例如，NASH)和纖維化時降低，在HCC腫瘤組織中達到最低。在非癌組織中，與健康組織相比，ALD和肝硬化肝臟的ZSG表達降低最顯著，支持了肝臟中的鋅缺乏狀態。

為了進一步研究圖中概述的四個AH數據集，檢查了來自健康和嚴重AH肝組織轉錄組的ZSG表達：GSE28619、GSE143318、GSE155907和GSE142530。在這四個數據集中，除MT1F在所有數據集中均達到顯著性外，所有ZSGs均一致下調。

我們接下來查詢了另一個肝組織數據集(登錄號phs003112.v1.p1)，該數據集包含來自基因型和表型數據庫(dbGaP)的人口統計學和血液檢查結果，以確定由轉錄組鋅特征評分定義的肝臟鋅狀態是否與任何臨床參數相關。在該數據集包含的79個肝臟轉錄組中，10個被分類為正常，41個AH，19個慢性HCV感染和10個MAFLD。與圖中概述的數據集一致，MAFLD的鋅特征評分與健康肝臟相似，而急性和慢性AH均表現出顯著降低的鋅特征評分。

接下來，將個體鋅特征評分與人口統計學信息(年齡)、血液檢查結果(例如，白細胞計數)、肝功能測試(例如，AST)和預測評分(例如，終末期肝病模型[MELD])相關聯。使用整個數據集，鋅特征評分顯示與血小板計數、白蛋白(ALB)和鈉呈強正相關，同樣與AST、ALP、TBIL和INR呈強負相關。在AH患者亞組(n=41)中，只有與AST的負相關仍然顯著。描繪鋅特征評分與白蛋白、AST和INR之間相關性的散點圖突出了ALD患者與隊列其余部分之間的差異。在ALD患者中，較低的肝臟鋅特征評分與低血清白蛋白和低血小板計數(血小板減少癥)以及延長的凝血時間(INR)相關，提示肝功能不良，同時與AST升高(肝臟炎癥和肝細胞死亡的標志物)相關。

為了確定肝臟鋅在AH發病機制中的作用，查詢了三個嚴重AH的肝活檢轉錄組數據集：GSE94397 (n=71)、GSE94399 (n=38)和GSE103580 (n=110)。此外，從所有三個數據集中生成了一個合并的、經過批次校正的數據集，包含219個樣本。為每個患者樣本生成了肝臟鋅特征評分，并隨后與所有四個數據集中的其他每個基因進行了相關性分析。圖5A展示了所有四個數據集中前50個正相關基因。發現鋅特征評分與感染急性期反應的多個成員基因呈正相關，包括補體(C5, C9)、血清淀粉樣蛋白(SAA1, SAA2)和C反應蛋白(CRP)。對所得相關系數排序列表進行的基因集富集分析表明，鋅特征評分與鋅穩態和反應以及急性炎癥反應(包括補體激活和急性期反應)相關。有趣的是，還鑒定出了生物能量和代謝反應的富集，包括ATP合成和氧化磷酸化，以及氨基酸/脂肪酸分解代謝。接下來，將每個數據集中的樣本根據其鋅特征評分分為四分位數并進行比較。代表具有最高鋅特征評分的患者的上四分位數與具有最低鋅特征評分的下四分位數進行了比較。急性期反應基因α-1-酸性糖蛋白1(ORM1)、血清淀粉樣蛋白A1(SAA1)、C反應蛋白(CRP)和補體成分9(C9)在具有較高鋅特征評分的患者中持續較高。類似地，蛋白質分解代謝基因如谷氨酸脫氫酶(GLUD1)和精氨酸酶1(ARG1)(負責分解生糖氨基酸谷氨酸和精氨酸)在所有數據集中持續較高，但未觀察到顯著差異。

急性期反應期間鋅會迅速流入肝臟，因此我們試圖確定肝臟鋅是否是產生急性期反應物所真正必需的。急性期反應是感染后肝臟對炎癥介質(如IL-6、IL-1β和TNF)刺激肝細胞的反應。由于巨噬細胞是肝臟炎癥反應的主要介質，我們首先研究了巨噬細胞IL-6和IL-1β的產生對鋅耗竭的反應。將單核細胞來源的巨噬細胞在模擬、ZnD或ZnD + 50 μM ZnSO₄培養基中培養過夜，然后用脂多糖(LPS)的免疫反應成分Kdo2-脂質A(KLA)刺激6小時。巨噬細胞細胞內鋅和MT1F表達在鋅耗竭培養基中顯著降低，支持了細胞內鋅的減少。KLA誘導的IL6和IL1B表達在鋅耗竭后顯著降低，并在添加ZnSO₄后恢復。分泌的IL-6在響應鋅耗竭時減少，而IL-1β不受影響。

接下來使用IL-1β和IL-6(各20 ng/ml)刺激Huh-7細胞和肝臟類器官單層中的急性期反應。Huh-7細胞的SAA1和ORM1表達在6小時IL-1β和IL-6處理后均增加，但只有ORM1受細胞鋅狀態影響，顯示鋅耗竭樣本中表達降低，即使在添加鋅后也是如此。在細胞因子刺激后測量了Huh-7培養基中SAA1蛋白的分泌，但未檢測到。與Huh-7結果一致，在類器官模型中，SAA1轉錄本表達和蛋白分泌不受鋅濃度影響。在類器官培養物中未檢測到ORM1，但急性期反應物C4BPA同樣不受鋅影響。總之，這些數據表明，AH中的鋅缺乏可能通過限制肝臟中炎癥介質的表達來抑制急性期反應的啟動。

雖然鋅缺乏的廣泛臨床癥狀在人類中已有充分描述，但由于臨床研究的局限性：復雜的臨床病例、眾多的獨立變量、患者合并癥以及組織獲取有限等，其對各器官和系統的獨特影響一直難以確定。為了幫助克服這些限制，我們開發并驗證了一個九基因鋅特征譜，用于估計組織內的鋅含量，這得到了人類和小鼠鋅補充和鋅限制研究的支持。因此，這項工作的發現可以分為兩個主題，將在本文中討論：1) 使用當代方法生成和驗證轉錄組鋅特征譜以量化組織鋅；2) 結合原代細胞培養模型和新的鋅耗竭方法來證明鋅缺乏如何影響肝臟對感染的急性期反應。我們使用了鋅缺乏的ALD肝臟轉錄組來研究組織中的鋅缺乏，但所提出的鋅特征譜很可能用于探究不同組織和疾病狀態中的鋅狀態。

研究細胞內鋅對信號通路作用的既定方法主要依賴于鋅螯合劑(如TPEN)和癌細胞系，其結果與我們的發現不一致。雖然TPEN用于螯合鋅，但它已在細胞培養研究中用于螯合銅、鈣和鐵，此外還螯合鋅。TPEN具有細胞滲透性，因此可以置換占據細胞內酶、核酸結合等作用的金屬，這不能很好地代表體內發生的鋅缺乏狀態。我們的鋅耗竭方法使用了與S100A