《Chemico-Biological Interactions》：miR-133a-3p promotes T-2 toxin-induced chondrocyte damage via targeting IGF1R
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本研究利用miRNA技術探究T-2毒素誘導軟骨損傷機制，發現miR-133a-3p在受損軟骨中高表達，通過靶向IGF1R促進ECM降解及軟骨細胞凋亡，其抑制劑則逆轉此效應，共轉染實驗證實該調控路徑。
羅康婷|王玲玉|張正彥|胡一凱|趙成宇|于水園|李倩|董在超|沙彤彤|王淼|左娟|竇彥杰|張煥霞|周國玉|岳芭|于芳芳
鄭州大學公共衛生學院環境衛生系，中國河南省鄭州市科學大道100號，450001
摘要
T-2毒素是Kashin-Beck病的重要環境風險因素之一，該疾病會嚴重損害軟骨。本研究利用miRNA來探究T-2毒素的毒性機制。研究發現，在T-2毒素引起的軟骨組織損傷和軟骨細胞損傷中，miR-133a-3p的表達顯著升高。miR-133a-3p的過表達促進了T-2毒素誘導的細胞外基質降解和軟骨細胞凋亡；而抑制miR-133a-3p則產生了相反的效果。這些結果表明miR-133a-3p參與了T-2毒素誘導的軟骨細胞損傷過程。生物信息學分析和雙熒光素酶實驗表明，IGF1R是miR-133a-3p的靶標。IGF1R的小干擾RNA（Si-IGF1R）進一步加劇了T-2毒素對軟骨細胞的損傷。將miR-133a-3p模擬物/抑制劑與Si-IGF1R共同轉染到軟骨細胞中，結果顯示miR-133a-3p模擬物增強了Si-IGF1R的效應，這與miR-133a-3p抑制劑的效應相反。因此，miR-133a-3p通過靶向IGF1R來促進T-2毒素誘導的軟骨細胞損傷。
引言
Kashin-Beck病（KBD）是一種地方性的慢性骨關節炎疾病，主要發生在兒童和青少年中，成年患者的殘疾率較高[1]。KBD的主要病變表現為骺板軟骨和關節軟骨深層的細胞退化和壞死[2,3]。目前，KBD的發病機制尚不明確。多數研究認為硒缺乏和谷物中的T-2毒素污染是該疾病的主要環境風險因素[4,5]。T-2毒素廣泛存在于谷物和動物飼料中，由于其低分子量和強親脂性，可通過口腔、呼吸道和皮膚接觸引發全身毒性[6,7]。過量攝入T-2毒素會導致骨骼和軟骨發育障礙[8]。KBD地區的谷物中T-2毒素含量顯著高于其他地區，且KBD患者的T-2毒素檢出率更高，這會導致軟骨深層細胞壞死[9,10]。體內實驗表明，T-2毒素會導致大鼠的細胞外基質（ECM）代謝失衡，進而引發關節軟骨降解和骺板異常[11]。然而，T-2毒素引起關節軟骨病變的具體機制仍需進一步深入研究。
微小RNA（miRNA）是一種長度在18到23個核苷酸之間的短鏈非編碼RNA分子[12]。miRNA通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區（UTR）特異性結合，抑制mRNA翻譯或直接促進mRNA降解[13]。miRNA參與多種生理和病理調控過程，在細胞分化、凋亡和ECM降解中起著關鍵作用[14,15,16]。我們之前的轉錄組測序發現miR-133a-3p在大鼠關節軟骨凋亡中起重要作用[17]。研究顯示miR-133a-3p與骨骼系統密切相關；轉錄組測序結果顯示，miR-133a-3p在骨關節炎患者中的表達顯著上調[18]。另一項研究中，將miR-133a-3p模擬物轉染到軟骨細胞后進行轉錄組測序，發現miR-133a-3p參與骨骼發育過程[19]。此外，miR-133a-3p通過直接作用于胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）來抑制PI3K/AKT信號通路，從而抑制前列腺癌的骨轉移[20]。這些結果表明miR-133a-3p參與骨骼發育過程，但其在軟骨中的具體作用機制尚未明確。
在本研究中，我們建立了體內和體外模型來研究T-2毒素引起的軟骨病變和軟骨細胞損傷。隨后構建了miR-133a-3p模擬物和抑制劑，以明確miR-133a-3p對T-2毒素誘導的軟骨細胞損傷的調控作用。進一步預測并驗證了IGF1R為miR-133a-3的直接靶基因，并構建了IGF1R的小干擾RNA（Si-IGF1R）模型，以研究IGF1R對T-2毒素誘導的軟骨細胞損傷的影響。最終發現，miR-133a-3k模擬物/抑制劑與Si-IGF1R的共同轉染增強了miR-133a-3的效應，這與miR-133a-3抑制劑的效應相反。因此，本研究旨在探索miRNA調控T-2毒素誘導的軟骨細胞損傷的機制，為闡明KBD的發病機制提供新的理論依據。
動物與處理方法
從河南省實驗動物中心獲取了36只4周大的SPF Sprague–Dawley雄性大鼠，將其置于標準環境條件下飼養（溫度22 ± 2°C，濕度40–60%，12小時光照/黑暗周期），并提供自由食物和飲水。適應一周后，將大鼠隨機分為對照組、低劑量組（100 ng/g體重/天）和高劑量組（200 ng/g體重/天）。經過4周的口服暴露后，對大鼠進行麻醉并采集膝關節軟骨進行分析。
暴露于T-2毒素的軟骨病變中miR-133a-3p的表達增加
如圖1A所示，對照組的軟骨細胞數量較多、結構有序，基質染色明顯；而隨著T-2毒素濃度的增加，細胞數量減少，結構紊亂，基質染色變弱。Western blot結果顯示，T-2毒素組中MMP13蛋白的表達水平顯著升高，而COL2A1蛋白的表達水平隨T-2毒素濃度的增加而降低（圖1B–D）。此外，Bcl-2蛋白的表達也發生了變化
討論
T-2毒素已被確認為Kashin-Beck病的主要環境風險因素[24]。人體攝入T-2毒素后，該毒素在消化道被吸收并導致軟骨病變[25,26,27]。我們之前的轉錄組測序發現，miR-133a-3p在大鼠軟骨中T-2毒素誘導的凋亡過程中起重要作用，其表達水平上調[17]。然而，miR-133a-3p在T-2毒素誘導的軟骨細胞損傷中的具體機制尚未明確
結論
綜上所述，miR-133a-3p在T-2毒素誘導的軟骨細胞損傷中的表達水平升高。miR-133a-3p的過表達顯著促進了T-2毒素誘導的細胞外基質降解和軟骨細胞凋亡。miR-133a-3p直接靶向IGF1R，并通過這一途徑促進T-2毒素誘導的軟骨細胞損傷。
作者貢獻聲明
羅康婷：撰寫初稿、數據可視化、數據整理。王玲玉：數據可視化、實驗研究。張正彥：數據可視化、實驗研究。胡一凱：數據可視化、實驗研究。趙成宇：數據可視化、實驗研究。于水園：數據可視化、實驗研究、數據整理。李倩：數據可視化、實驗研究、數據整理。董在超：數據可視化、實驗研究。沙彤彤：數據可視化、實驗研究。王淼：數據可視化、實驗研究。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的可能影響本文研究的財務利益或個人關系。
致謝
本研究得到了國家自然科學基金（項目編號：82003400）和河南省自然科學基金（項目編號：252300423223）的支持。
