盡管世界衛(wèi)生組織（WHO）已宣布SARS-CoV-2不再構(gòu)成國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，但病毒的持續(xù)傳播和進(jìn)化仍帶來流行病學(xué)不確定性。早期疫苗主要針對刺突（S）蛋白的免疫優(yōu)勢區(qū)域，特別是受體結(jié)合域（RBD），但這些區(qū)域的突變積累導(dǎo)致了免疫逃逸，從而降低了基于原型株疫苗的效力。因此，開發(fā)針對保守表位的泛冠狀病毒疫苗對于疫情控制至關(guān)重要。

當(dāng)前廣譜冠狀病毒疫苗的設(shè)計(jì)策略主要有兩種：一是靶向保守的S蛋白結(jié)構(gòu)域（如HR121和HR1LS疫苗）；二是旨在引發(fā)協(xié)同B細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答的多表位疫苗（如UB-612和RBD-HLA-EP疫苗）。然而，基于RBD的策略可能加速免疫逃逸，因此需要靶向更穩(wěn)定的病毒區(qū)域。下一代疫苗中保守B細(xì)胞和T細(xì)胞表位的協(xié)同作用可能克服當(dāng)前限制。

開發(fā)有效的T/B細(xì)胞表位疫苗面臨兩個主要挑戰(zhàn)：HLA限制和次優(yōu)免疫原性。研究表明，合成多肽（SLPs）比最小表位肽能誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞反應(yīng)。更重要的是，多肽設(shè)計(jì)能夠整合多個表位，從而拓寬HLA覆蓋范圍。基于這些原理，本研究設(shè)計(jì)了一個獨(dú)特的疫苗平臺，將保守的T/B細(xì)胞表位結(jié)構(gòu)整合到七肽重復(fù)序列1-七肽重復(fù)序列2（HR1-HR2）三聚體支架蛋白中。

MHC的多態(tài)性是限制多肽疫苗保護(hù)效力的因素之一。根據(jù)免疫表位數(shù)據(jù)庫（IEDB），HLA-A02:01等位基因在全球HLA-A亞型中分布頻率較高。為鑒定SARS-CoV-2 S蛋白的免疫優(yōu)勢T細(xì)胞表位，我們基于IEDB數(shù)據(jù)庫繪制了HLA-A02:01限制性CD8⁺T細(xì)胞表位圖譜。同樣，也繪制了S蛋白的B細(xì)胞線性表位圖譜。

值得注意的是，S1_269-277和S2_976-1008中的CD8⁺T細(xì)胞表位呈現(xiàn)出高免疫原性，而S3_809-824和S4_1142-1170中的B細(xì)胞線性表位呈現(xiàn)強(qiáng)反應(yīng)性。隨后的比較序列分析發(fā)現(xiàn)，S2_976-1008（命名為VV長肽）和S4_1142-1170區(qū)域是冠狀病毒S蛋白中進(jìn)化上保守的結(jié)構(gòu)域。前期研究已證實(shí)P4肽（S_1139-1170aa）含有中和抗體表位，S_1129-1145肽也被證實(shí)含有B細(xì)胞抗原表位。因此，我們將擴(kuò)展的S_1129-1170區(qū)域命名為VS長肽。結(jié)構(gòu)分析展示了它們在S蛋白中的保守模式和結(jié)構(gòu)位置。IEDB分析在VV/VS區(qū)域中鑒定出了HLA結(jié)合的CD8⁺T細(xì)胞表位和鼠源MHC-I反應(yīng)性表位。結(jié)果表明，VV肽含有一個交叉反應(yīng)表位，而VS含有兩個具有人/鼠雙MHC-I結(jié)合能力的表位。基于這些特征，我們合成了五個VV衍生（SP1-SP5）和兩個VS衍生（SP6-SP7）肽段進(jìn)行驗(yàn)證。計(jì)算模型預(yù)測這些表位可提供94%的全球人群覆蓋率。

為了從功能上表征保守VV和VS長肽的免疫原性，我們使用從16名COVID-19康復(fù)期供者分離的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）進(jìn)行了離體刺激實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞因子微球陣列分析顯示，用VV肽池刺激顯著增強(qiáng)了IFN-γ和TNF-α的分泌，而VS肽池主要增強(qiáng)了IFN-γ和IL-2的分泌。此外，用VS長肽刺激顯著促進(jìn)了Th1型細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL-2）的協(xié)同分泌。

我們通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步量化了刺激后PBMC中活化誘導(dǎo)標(biāo)記物（AIM）陽性T細(xì)胞亞群的比例。定量分析顯示，在用VS肽池和VV肽池刺激后，AIM⁺CD8⁺T細(xì)胞和AIM⁺CD8⁺效應(yīng)記憶T細(xì)胞（Tem）的比例均顯著增加。此外，用VV長肽或VS肽池刺激也顯著增加了AIM⁺CD4⁺T細(xì)胞和AIM⁺CD4⁺Tem細(xì)胞的比例，證實(shí)了這些肽段強(qiáng)大的免疫刺激能力。這些結(jié)果證明VV和VS長肽能夠有效引發(fā)COVID-19康復(fù)者中廣泛反應(yīng)的特異性T細(xì)胞免疫。

為增強(qiáng)免疫原性，我們通過將VV和VS肽段整合到保守的HR1-HR2支架中，設(shè)計(jì)出了HR1-VV-HR2-VS融合蛋白。HR1-HR2是關(guān)鍵的膜融合結(jié)構(gòu)域，也是有前景的通用冠狀病毒疫苗靶點(diǎn)。使用AlphaFold2預(yù)測了該融合蛋白的三聚體結(jié)構(gòu)，并且兩種融合蛋白均成功在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)和純化。

SDS-PAGE分析顯示，兩種融合蛋白的條帶表觀分子量均大于理論預(yù)測值，提示可能存在糖基化。這一假設(shè)隨后通過去糖基化及SDS-PAGE分析得到證實(shí)。該觀察結(jié)果與尺寸排阻色譜和分析型超速離心分析結(jié)果一致，后者測得的分子量比預(yù)期的三聚體組裝體分子量高出30-36%。交聯(lián)分析證實(shí)了三聚體組織形式，同時(shí)也檢測到單體和二聚體群體，后者可能是由于交聯(lián)不完全所致。圓二色光譜分析顯示，該蛋白主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)，并具有高熱穩(wěn)定性。綜上所述，以上生化數(shù)據(jù)表明HR1-VV-HR2-VS和HR1-HR2蛋白在溶液中主要采取三聚體形式。

在C57BL/6野生型（WT）和HLA-A02:01轉(zhuǎn)基因小鼠中，系統(tǒng)比較了HR1-VV-HR2-VS與單獨(dú)的VV/VS肽段的免疫原性。融合蛋白免疫在野生型小鼠中，針對其組成表位（SP1-4, SP6-7）誘導(dǎo)了顯著強(qiáng)于多肽免疫的IFN-γ⁺T細(xì)胞反應(yīng)。雖然HLA-A02:01轉(zhuǎn)基因小鼠由于HLA限制性表現(xiàn)出更局限的反應(yīng)，但對于特定表位（SP1, SP6-7）仍觀察到增強(qiáng)的IFN-γ產(chǎn)生，且HR1-VV-HR2-VS免疫組的反應(yīng)優(yōu)于多肽對照組。此外，HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出比野生型更高的IFN-γ⁺T細(xì)胞頻率。

同樣，對HR1/HR2結(jié)構(gòu)域表位（SP8-13）的比較分析顯示，HR1-VV-HR2-VS免疫比單獨(dú)的HR1-HR2支架增強(qiáng)了IFN-γ⁺T細(xì)胞反應(yīng)。野生型小鼠對SP10和SP12-13的反應(yīng)顯示出顯著更高的倍數(shù)增加，而SP11反應(yīng)在HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠中更高，這證明了融合設(shè)計(jì)在增強(qiáng)插入表位和支架衍生表位反應(yīng)方面的雙重優(yōu)勢。

為了評估抗體介導(dǎo)的免疫，我們量化了免疫后野生型和HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠脾淋巴細(xì)胞中的生發(fā)中心（GC）B細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）。結(jié)果顯示，在野生型小鼠中，與PBS組、單獨(dú)的CpG/Al(OH)?佐劑組、單獨(dú)的VV或VS長肽免疫組相比，HR1-VV-HR2-VS免疫組均表現(xiàn)出顯著增加的GC B細(xì)胞和Tfh細(xì)胞比例。

與野生型小鼠一致，免疫HR1-VV-HR2-VS的HLA-A02:01轉(zhuǎn)基因小鼠與PBS對照組相比，也表現(xiàn)出顯著升高的GC B細(xì)胞和Tfh細(xì)胞頻率。值得注意的是，免疫HR1-VV-HR2-VS的野生型小鼠脾淋巴細(xì)胞中GC B細(xì)胞和Tfh細(xì)胞的頻率顯著高于HLA-A02:01轉(zhuǎn)基因小鼠。分析表明，盡管HR1-HR2支架是驅(qū)動生發(fā)中心反應(yīng)的主要因素，但肽段的整合起到了協(xié)同增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用，凸顯了基于融合的設(shè)計(jì)方案的優(yōu)越效力。

對免疫小鼠血清的體液免疫分析顯示，在野生型小鼠中，HR1-VV-HR2-VS和HR1-HR2疫苗配方誘導(dǎo)的抗原特異性抗體滴度顯著高于HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠。出乎意料的是，單獨(dú)的VS肽免疫未能通過ELISA檢測到抗體。然而，使用IFA佐劑的VS肽（免疫程序）顯示出較低但可檢測的VS特異性IgG滴度，這表明單獨(dú)的肽段免疫原性欠佳，需要佐劑優(yōu)化。此外，HR1-VV-HR2-VS融合蛋白表現(xiàn)出更優(yōu)的免疫原性，誘導(dǎo)的VS特異性抗體滴度是單獨(dú)VS肽的6.8倍（野生型）和1.3倍（轉(zhuǎn)基因型）。

用VS、HR1-HR2或HR1-VV-HR2-VS抗原免疫的小鼠血清，相對于單獨(dú)的佐劑對照組，對SARS-CoV-2原型假病毒表現(xiàn)出顯著的中和活性。雖然用VS肽或HR1-HR2免疫的小鼠血清對Omicron B.1.1.529的中和作用減弱，但HR1-VV-HR2-VS組保持了相當(dāng)?shù)男ЯΑ＿@些結(jié)果表明HR1-VV-HR2-VS抗原可能誘導(dǎo)具有更廣泛交叉反應(yīng)活性的中和抗體。

在293T細(xì)胞膜上表達(dá)冠狀病毒S蛋白會通過與相鄰293T細(xì)胞上表達(dá)的ACE2特異性結(jié)合誘導(dǎo)合胞體形成。HR1-VV-HR2-VS組的血清顯示出對SARS-CoV-2原型株、Omicron B.1.1.529和HCoV-NL63廣泛的融合抑制作用，表明其具有廣泛的融合阻斷能力。來自HR1-VV-HR2-VS免疫的野生型小鼠的血清，與單獨(dú)的佐劑組相比，表現(xiàn)出抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（ADCP）活性增強(qiáng)。與生發(fā)中心反應(yīng)一致，血清抗體的融合抑制活性主要由HR1-HR2支架蛋白介導(dǎo)，而VS長肽則提供了額外的增強(qiáng)作用。

考慮到CpG/Al(OH)?組合的佐劑效力有限，我們進(jìn)一步引入了Montanide ISA 720VG（一種臨床上比IFA更安全的替代品）并評估了其在小鼠中的保護(hù)性免疫原性。所有免疫均采用ISA 720VG佐劑的配方肌肉注射進(jìn)行，以保持實(shí)驗(yàn)一致性。

用HR1-VV-HR2-VS免疫的小鼠，采用雙次接種方案，經(jīng)鼻攻擊HCoV-229E。HR1-VV-HR2-VS免疫防止了顯著的體重下降，將肺部病毒載量降低了58-65%，并減輕了肺部病理變化（包括明顯的炎性細(xì)胞浸潤和肺泡間隔增厚），顯示出優(yōu)于單獨(dú)佐劑對照組的保護(hù)效力。

基于其優(yōu)異的保護(hù)效力，選擇Montanide ISA 720VG作為后續(xù)SARS-CoV-2攻擊研究的佐劑。K18-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠先用滅活疫苗初免，然后用候選疫苗加強(qiáng)免疫兩次。末次免疫后兩周，小鼠經(jīng)鼻攻擊SARS-CoV-2原型株（Wuhan-Hu-1）或KP.2變異株，并在感染后4天評估病毒載量和病理變化。HR1-VV-HR2-VS加強(qiáng)免疫顯示出優(yōu)異的保護(hù)作用，與PBS和滅活疫苗對照組相比，分別將肺部病毒載量降低了76%和79%（針對原型株），以及64%和36%（針對KP.2變異株）。單劑滅活疫苗將KP.2病毒載量降低了43%，但對原型株無保護(hù)作用，而HR1-HR2免疫分別對野生型株和KP.2株顯示出47%和31%的病毒載量降低。HR1-VV-HR2-VS疫苗接種顯著減輕了肺部病理變化，與對照組相比，減少了炎性細(xì)胞浸潤并保留了肺泡結(jié)構(gòu)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明HR1-VV-HR2-VS加強(qiáng)免疫可針對多種冠狀病毒，包括SARS-CoV-2原型株、KP.2變異株和異源的HCoV-229E，提供廣泛的保護(hù)。

通過比較七種人類冠狀病毒和SARS-CoV-2變異株的刺突蛋白，我們鑒定出兩個保守且免疫優(yōu)勢的表位：VV（T細(xì)胞）和VS（B細(xì)胞），并通過COVID-19康復(fù)者PBMC驗(yàn)證。隨后，我們利用SARS-CoV-2天然的HR1-HR2三聚化機(jī)制，設(shè)計(jì)了HR1-VV-HR2-VS融合蛋白。用該構(gòu)建體免疫，與單獨(dú)的肽段相比，增強(qiáng)了T細(xì)胞反應(yīng)和VS特異性體液免疫，同時(shí)在小鼠模型中顯示出對SARS-CoV-2原型株、KP.2變異株和HCoV-229E攻擊的交叉保護(hù)效力。

針對保守T/B細(xì)胞表位的表位聚焦疫苗在開發(fā)廣譜保護(hù)性冠狀病毒疫苗方面展現(xiàn)出前景。CoVac-1的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示其能夠誘導(dǎo)持續(xù)、耐變異株的IFN-γ反應(yīng)和強(qiáng)大的T細(xì)胞免疫，即使在B細(xì)胞缺陷患者中也是如此。我們的表位中心疫苗設(shè)計(jì)利用進(jìn)化上受限的S蛋白區(qū)域，通過含有具有94%全球HLA-I覆蓋率的混雜CD8⁺T細(xì)胞表位的VV/VS長肽，產(chǎn)生持久、交叉反應(yīng)的免疫力。Pereira Neto等人的研究證實(shí)，S2亞基內(nèi)的保守T細(xì)胞表位區(qū)域（包括HR1結(jié)構(gòu)域和VV長肽）顯著增強(qiáng)了跨β冠狀病毒的交叉反應(yīng)性T細(xì)胞識別。這一發(fā)現(xiàn)為這些區(qū)域的廣譜疫苗潛力提供了獨(dú)立支持。

幾種基于HR1/HR2的疫苗候選物已顯示出良好的免疫原性和保護(hù)效力。例如，HR121在多種動物模型中表現(xiàn)出強(qiáng)大的效力，而HR1LS則能引發(fā)廣譜中和抗體。我們的數(shù)據(jù)顯示，HR1-HR2免疫對小鼠KP.2變異株攻擊的保護(hù)有限，這可能歸因于KP.2 S蛋白HR1結(jié)構(gòu)域內(nèi)的關(guān)鍵突變（S939F, Q954H, 和 N969K）。比較分析顯示，與HR1-HR2構(gòu)建體相比，HR1-VV-HR2-VS融合肽對Omicron KP.2攻擊表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的保護(hù)效力，顯示出顯著更低的病毒載量和減輕的肺部病理。這種保護(hù)優(yōu)勢表明，整合的VV/VS長肽在功能上與核心HR1-HR2結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，以拓寬免疫識別。觀察到的對異源HCoV-229E感染的交叉保護(hù)進(jìn)一步證實(shí)了這種協(xié)同作用。我們的研究結(jié)果表明，與僅包含HR1和HR2結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體相比，HR1-VV-HR2-VS融合蛋白表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)且更廣泛的保護(hù)效力。我們的研究建立了一種將保守T/B細(xì)胞表位與HR1-HR2支架融合作為新型疫苗抗原的創(chuàng)新方法。該設(shè)計(jì)成功引發(fā)并發(fā)的體液和細(xì)胞免疫，標(biāo)志著從表位定位到功能性抗原設(shè)計(jì)的概念轉(zhuǎn)變，以開發(fā)廣譜多肽疫苗。

COVID-19患者血清對異源HCoV S2結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性，支持其作為泛冠狀病毒疫苗靶點(diǎn)的潛力。然而，S2亞基引發(fā)的中和抗體反應(yīng)有限，這反映在HR1-VV-HR2-VS免疫后觀察到的病毒清除不完全和適中的中和抗體滴度上。因此，靶向S2的疫苗高度依賴佐劑選擇以獲得最佳免疫原性。CF501佐劑在HR1LS疫苗接種中被證明比鋁佐劑誘導(dǎo)更高的中和抗體滴度，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致，即弗氏佐劑增強(qiáng)了VS肽特異性體液免疫。未來的工作將通過佐劑和遞送系統(tǒng)評估來優(yōu)化此平臺。

我們觀察到野生型與HLA-A02:01轉(zhuǎn)基因小鼠對肽段SP2-4和SP10-12的T細(xì)胞反應(yīng)存在差異。這些差異可能涉及HLA限制性和結(jié)合親和力的變化。例如，SP4表位不結(jié)合HLA-A02:01。此外，SP3、SP10和SP13中的表位被預(yù)測為弱結(jié)合。另一個因素可能是刺激肽與抗原呈遞細(xì)胞自然加工的多肽不匹配。這種不匹配可能是導(dǎo)致對SP2和SP12中HLA-A02:01結(jié)合表位缺乏顯著反應(yīng)的原因。此外，與野生型對照相比，HLA-A02:01轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出減弱的生發(fā)中心反應(yīng)和體液反應(yīng)，這可能是由于人β-2微球蛋白替代損害了FcRn介導(dǎo)的IgG保護(hù)作用。這導(dǎo)致了IgG分解代謝加速，并在相同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生顯著低于野生型小鼠的抗原特異性抗體滴度。另外，在野生型小鼠中，VS肽免疫顯著降低了Tfh細(xì)胞頻率，這可能是由IL-2介導(dǎo)的Tfh分化抑制所導(dǎo)致。與此機(jī)制一致，VS長肽和肽池在人類PBMC中均能有效刺激IL-2產(chǎn)生。

盡管如此，本研究有兩個主要局限：盡管病毒載量顯著降低，但仍觀察到不完全的病毒清除；并且未評估粘膜免疫。未來的工作將優(yōu)化佐劑配方，特別是TLR激動劑和STING激活劑，以增強(qiáng)全身和粘膜保護(hù)。

總而言之，我們的研究引入了一種合理的疫苗設(shè)計(jì)，它基于兩個協(xié)同組成部分：保守高效T/B細(xì)胞表位的戰(zhàn)略性整合，以及發(fā)揮雙重作用的HR1/HR2支架。該支架蛋白不僅強(qiáng)有力地增強(qiáng)了這些表位的免疫原性，還同時(shí)提供了獨(dú)立的保護(hù)性免疫力。該策略有效地超越了最小表位疫苗的局限性，并為廣譜保護(hù)建立了一個多功能平臺。