《Nature Methods》：Integration of imaging-based and sequencing-based spatial omics mapping on the same tissue section via DBiTplus
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本研究開發了DBiTplus技術，創新性地將測序型空間轉錄組與多重蛋白成像整合于同一切片，通過RNase H介導的cDNA回收保留組織形態，結合計算流程實現成像引導的去卷積，在冷凍/FFPE樣本中成功繪制單細胞分辨率空間圖譜，為淋巴瘤轉化機制研究提供了強大工具。
在生物醫學研究領域，全面解析組織微環境需要同時獲取基因表達和蛋白定位的空間信息。然而，傳統空間組學技術存在明顯局限：測序型方法（如Slide-seq）可獲轉錄組覆蓋但分辨率有限，成像型方法（如MERFISH）雖有高分辨率卻通量不足。更關鍵的是，現有多組學整合多采用相鄰切片分別檢測后計算匹配，因組織異質性導致對齊不準。
為突破這一技術瓶頸，耶魯大學團隊在《Nature Methods》發表了DBiTplus技術，創新性地在同一組織切片上整合測序型空間轉錄組與多重蛋白成像（mxIF）。該方法的核心突破在于：通過優化cDNA回收策略（特別是RNase H酶解法），在完成空間條形碼測序后仍能保持組織完整性進行后續CODEX/CellScape成像，真正實現"一次實驗，多維信息"的同步采集。
關鍵技術方法包括：微流控空間條形碼（50×50通道）、RNase H介導的cDNA回收、CODEX/CellScape多重成像、MaxFuse算法引導的空間數據整合。研究使用了小鼠胚胎、人淋巴結及淋巴瘤等冷凍/FFPE樣本驗證。
DBiTplus工作流程優化
通過對比NaOH、DMSO和RNase H三種cDNA回收方法，發現RNase H在保持組織形態方面表現最優（Extended Data Fig. 1b-c）。實驗顯示，經RNase H處理的小鼠脾臟切片可獲得14種蛋白標志物的清晰染色，包括CD45R+B細胞和CD169+巨噬細胞。對E11小鼠胚胎的測試表明，該方法可檢測約2萬個基因，平均每個斑點捕獲約1,200個基因和3,300個UMI（圖2b-d），與標準DBiT-seq高度相關（R=0.99）。
多模態數據整合與驗證
研究人員開發了基于MaxFuse算法的計算流程，將mxIF細胞蛋白數據與DBiTplus斑點基因表達矩陣整合為統一特征矩陣（圖1b）。通過組織邊界圖像配準，實現了跨模態細胞對齊。在人類淋巴結樣本中，該技術成功識別出B細胞（MS4A1+）、髓質平滑肌細胞（MYH11+CALD1+）和巨噬細胞（MARCO+）等5個轉錄組集群（圖3b-c）。與TACCO、Cell2location等算法相比，該方法在細胞類型去卷積方面表現更優（圖3j-k）。
淋巴瘤轉化機制解析
應用DBiTplus研究邊緣區淋巴瘤（MZL）樣本發現，大型B細胞（CD20brightKi67high）與小型B細胞（CD20dimKi67low）存在顯著轉錄差異。大型B細胞上調IL6ST（白細胞介素-6信號）、CLU（凋亡抑制）等基因，表明生存能力增強；同時NFKBIA上調提示NF-κB通路異常活化。通路分析顯示大型B細胞中非經典NF-κB信號、染色質修飾和PI3K-AKT通路激活（圖4h-i）。偽時間分析進一步揭示了從小型到大型B細胞的連續分化軌跡，伴隨MS4A1、PAX5等B細胞特征基因下調，以及PTMA、PRRX1等增殖相關基因上調（圖4j-l）。
Richter轉化研究
在慢性淋巴細胞白血病（CLL）向彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）轉化（Richter轉化）研究中，DBiTplus揭示了轉化區域的免疫特征：DLBCL區富含CD163+巨噬細胞、CD274（PD-L1）表達上調，T細胞衰竭標志物（CD279）升高（圖5h-i）。差異表達基因分析發現，大型B細胞中p53和凋亡信號通路上調，而PTEN下調，同時mTOR、ERK/MAPK等增殖通路受抑制，反映了Richter轉化特有的表觀遺傳重編程。
miRNA空間圖譜
DBiTplus還能同步分析miRNA表達，發現miR-21（通過抑制PTEN激活PI3K-AKT通路）、miR-155等在淋巴瘤轉化中異常表達（Extended Data Fig. 10c-d）�？臻g聚類識別出7個miRNA集群，其中集群0和1與CLL-DLBCL組織學轉變區域對應。
本研究通過建立同一切片多組學整合技術，解決了空間生物學中模態對齊難題。DBiTplus不僅提供了單細胞分辨率的空間轉錄組-蛋白聯合圖譜，更在淋巴瘤轉化機制研究中發現了關鍵分子事件，為腫瘤微環境研究和臨床診斷提供了新的技術平臺。該技術的成功應用預示著空間多組學將向更高整合度、更高通量方向發展，有望在疾病機制研究和精準醫療中發揮更大價值。
