在類風濕關節炎（RA）的治療領域，盡管生物制劑的應用取得了顯著進展，但仍有超過50%的患者對初始治療無反應，5-30%的患者甚至對多種治療方案都抵抗，這成為臨床上面臨的重大挑戰。難治性RA患者往往表現出更多的非炎癥性疼痛，提示其背后可能存在不同于典型炎癥的病理生理機制。以往的研究多聚焦于免疫細胞，而對滑膜組織中另一種主要細胞——成纖維細胞在治療抵抗中的作用了解甚少。成纖維細胞具有高度的異質性，其不同的功能狀態與疾病預后密切相關。尤其值得注意的是，纖維化過程，即以成纖維細胞過度活化、細胞外基質（ECM）過度沉積為特征的病理過程，在RA中的作用尚未得到充分研究。轉化生長因子β（TGFβ）是纖維化的核心介質，但其在RA滑膜組織中的具體作用模式尚不明確。

為了深入探究難治性RA的分子決定因素，研究人員在《Nature Immunology》上發表了最新研究成果。他們利用空間轉錄組技術，對早期RA患者治療前及治療6個月后的滑膜組織活檢樣本進行了分析。研究發現，在治療無效患者的基線活檢樣本中，血管組織微環境內的纖維化信號顯著增強，其特征是成纖維細胞高表達軟骨寡聚基質蛋白（COMP）。機制上，內皮細胞來源的Notch信號作為上游調控因子，通過誘導TGFβ亞型表達同時抑制TGFβ受體表達，精細調控成纖維細胞的TGFβ信號，從而形成了成纖維細胞對TGFβ敏感性的由近及遠的梯度分布。這種穩態模式可被Notch信號擾動所改變。治療后活檢樣本顯示，盡管免疫細胞顯著減少，但纖維化微環境卻發生擴張，這一過程可在RA患者來源的類器官中通過抑制Notch和TGFβ信號得以逆轉。該研究揭示了靶向TGFβ信號以抑制滑膜組織過度纖維化，作為難治性RA潛在治療新策略的重要性。

本研究的關鍵技術方法包括：對來自396.10研究的初治早期RA患者的滑膜活檢樣本進行高分辨率空間轉錄組分析；利用RA患者來源的滑膜類器官模型進行體外干預驗證；構建二維和三維的成纖維細胞與內皮細胞共培養體系，模擬體內微環境并分析細胞間相互作用；結合RNAscope原位雜交、免疫熒光、蛋白質印跡、酶聯免疫吸附測定等技術進行多組學驗證。樣本隊列來源包括弗林德斯醫學中心等多家機構的RA患者。

研究人員首先在17例初治早期RA患者的滑膜活檢樣本中，通過空間轉錄組分析識別出7種主要的組織微環境：富集成纖維細胞區、血管區、基質-脂肪區、襯里層成纖維細胞區、襯里層巨噬細胞區、T細胞與B細胞區以及漿細胞區。根據微環境組成，樣本可大致分為三類：富含基質-脂肪的、富含免疫微環境的、以及血管和成纖維細胞微環境擴增的。盡管基線微環境組成在緩解與非緩解患者間無顯著差異，但轉錄水平的差異可能區分預后。

通過分析更大的批量RNA測序數據，研究人員發現與非應答相關的基因特征在基質-脂肪、富集成纖維細胞和血管微環境中顯著富集，其中成纖維細胞的非應答評分最高。對成纖維細胞進行亞型分析，鑒定出五種亞型，其中以高表達_COL6A1、_COL8A1、_COMP等ECM基因為特征的纖維化成纖維細胞亞型與非應答特征關聯最強，并且在非緩解患者的治療前成纖維細胞中，纖維化評分顯著升高。該纖維化特征在系統性硬化癥和特發性肺纖維化等纖維化疾病的數據集中也高度富集，表明RA中的纖維化成纖維細胞與經典纖維化疾病中的肌成纖維細胞存在轉錄組重疊。

為了精確定位纖維化成纖維細胞，研究人員使用靶向50個基質相關基因的面板進行深度空間轉錄組分析。結果顯示，COMP高表達的成纖維細胞主要定位于少細胞區域和血管周圍區域的遠端層，而骨膜蛋白（POSTN）高表達的成纖維細胞則與血管周細胞標記物共定位，位于血管區域的近端層。對TGFβ亞型表達的分析發現，TGFB3轉錄本不僅與內皮細胞和周細胞標記物共定位，顯示其在血管和血管周圍的富集，還與包括POSTN、COMP和COL1A1在內的纖維化轉錄本重疊。免疫熒光染色證實了TGFβ蛋白的血管周圍定位，并且TGFβ信號活化的關鍵指標pSMAD3也僅限于血管區域的成纖維細胞。這些發現表明血管周圍微環境是纖維化信號的重要樞紐。

通過建立二維和三維共培養模型，研究人員發現內皮細胞可空間模式化成纖維細胞的轉錄程序�？拷鼉绕ぜ毎�的成纖維細胞高表達Notch靶基因和POSTN，而遠離內皮細胞的成纖維細胞則高表達COMP。同時，內皮細胞近端的成纖維細胞高表達TGFB1和TGFB3，但低表達TGFβ受體（TGFBR2和TGFBR3）；相反，遠離內皮細胞的成纖維細胞則表現出TGFβ受體表達逐漸增加的趨勢。這表明內皮細胞來源的信號通過配對調控TGFβ配體和受體，決定了TGF信號反應性的空間模式。

進一步機制探究發現，內皮細胞來源的Notch信號是成纖維細胞TGFβ信號的上游調控因子。抑制Notch信號可逆轉內皮細胞共培養誘導的TGFB1、TGFB3表達上調和TGFBR2、TGFBR3表達抑制。在體外用DLL4刺激成纖維細胞也可觀察到類似效應，并可被Notch抑制劑DAPT所逆轉。Notch信號主要通過調控TGFβ受體III（TGFBR3）的可用性來模式化成纖維細胞對TGFβ的反應性。

破壞穩態的Notch信號會激活纖維化基因表達程序。敲低內皮細胞特異性Notch配體DLL4后，共培養體系中COMP表達被解除抑制，同時TGFBR3表達升高，TGFB3表達降低，表明COMP表達成纖維細胞的擴張與DLL4敲低介導的TGFBRIII去抑制有關。

對17對治療前后配對滑膜樣本的分析顯示，治療后所有患者組均出現顯著的免疫耗竭，但纖維化微環境相對擴張。在大多數患者中，表達COMP的成纖維細胞比例增加，COMP高表達區域變得更加少細胞化，表明治療后表達COMP的成纖維細胞發生擴張并可能沉積纖維性ECM。

最后，研究人員在RA患者來源的滑膜類器官中驗證了靶向Notch和TGFβ信號的 therapeutic potential。用DAPT或TGFβ抑制劑處理類器官，均可顯著降低COMP、POSTN和前膠原蛋白Iα1的分泌。空間轉錄分析進一步證實，DAPT處理可顯著抑制成纖維細胞中TGFB1和TGFB3的表達，同時解除對TGFBR2和TGFBR3的抑制。

本研究首次系統地揭示了在類風濕關節炎滑膜組織中，內皮細胞來源的Notch信號通過精細調控成纖維細胞TGFβ配體與受體的表達，建立了成纖維細胞對TGFβ敏感性的空間梯度模式。這種模式在治療壓力下發生改變，導致纖維化成纖維細胞微環境擴張，與臨床治療抵抗密切相關。該發現不僅深化了對難治性RA病理機制的理解，將研究視角從免疫炎癥擴展至基質纖維化，而且為開發針對TGFβ信號（特別是TGFβ3亞型）的輔助療法，以預防難治性RA的發生提供了新的理論依據和潛在的干預靶點。