G蛋白偶聯受體（GPCR）是細胞通信的核心介質，也是最重要的藥物靶點類別。盡管既往研究利用純化受體在體外證實GPCR存在多種失活與激活狀態的動態平衡，且配體可依賴其效能（efficacy）調控該平衡，但配體效能如何在活細胞中編碼、以及是否存在多重受體狀態仍不明確。本研究通過遺傳密碼子擴展（genetic code expansion）和生物正交標記（bioorthogonal labelling）技術，針對原型GPCR——M₂毒蕈堿乙酰膽堿受體（M₂R）開發了一組熒光生物傳感器。這些傳感器可在完整細胞中實時監測激動劑促進的受體胞外域構象變化。

研究團隊在M₂R胞外區系統篩選了72個位點，最終獲得7個具有良好細胞膜表達及標記效率的傳感器位點（如Thr84、Glu175、Phe181等）。通過將非經典氨基酸TCO*K（trans-cyclooct-2-ene lysine）定點插入受體，并利用四嗪-花菁染料（Tet–Cy3）進行快速生物正交標記，實現了對單個氨基酸位點的高時空分辨率監測。所有傳感器均保留完整的G蛋白偶聯功能，且其熒光變化源于局部微環境變化（如疏水性/極性轉變），反映了受體激活相關的構象重排。

研究比較了不同效能激動劑（包括完全激動劑ACh、超激動劑iperoxo、部分激動劑arecoline和pilocarpine）激活M₂R時的構象響應。結果顯示，不同激動劑誘導的熒光變化幅度和方向存在顯著差異：iperoxo在多數位點（如M₂R⁸⁴、M₂R¹⁷⁵）引發比ACh更強的響應，而arecoline和pilocarpine則呈現部分激活特征。通過雷達圖可視化各激動劑的“構象指紋”，發現不同配體穩定了獨特的受體活性狀態組合，且這些狀態的分布與激動劑效能相關。例如，高效能激動劑傾向于誘導M₂R¹⁷⁵和M₂R⁴¹⁵位點的快速構象變化（對應高效信號復合物C1），而低效能激動劑pilocarpine則顯著促進M₂R¹⁸¹和M₂R¹⁸⁸位點的慢速響應（對應低效復合物C2）。

為探究G蛋白偶聯對受體構象的影響，研究過表達了核苷酸親和力降低的突變G蛋白亞基Gα_oA(G203T)，以穩定受體-G蛋白復合物。結果顯示，Gα_oA(G203T)過表達可選擇性地調控不同傳感器位點的響應：例如，在M₂R¹⁷⁵和M₂R⁴¹⁵位點，所有激動劑引發的熒光變化均被抑制，提示這些位點指示高效信號復合物（C1）的形成；而在M₂R¹⁸¹和M₂R¹⁸⁸位點，G蛋白過表達反而增強響應，表明這些位點對應低效復合物（C2）。此外，百日咳毒素（PTX）預處理實驗進一步證實，G_i/o蛋白的失活可消除C2相關信號，支持C2為GDP結合的低效復合物。

動力學分析揭示了配體特異的激活軌跡。高效激動劑（ACh、iperoxo）首先在數百毫秒內誘導C1形成，隨后在數秒內形成C2；而部分激動劑arecoline則通過獨特路徑優先穩定中間態C3和C4。值得注意的是，iperoxo幾乎不誘導C2形成，而pilocarpine強烈偏向C2，arecoline則表現出對G_o蛋白亞型的偏好性激活。這些時間分辨的構象變化表明，不同激動劑通過差異化的激活軌跡調控受體-G蛋白復合物的形成時序與穩態分布。

通過TRUPATH平臺評估M₂R對14種G蛋白的激活偏好，發現所有激動劑均主要激活G_i/o家族，但其效能譜存在顯著差異：iperoxo對多數G蛋白表現為超激動劑；arecoline對G_oA/G_oB顯示超激動活性，但對其他G_i/o成員為部分激動劑；pilocarpine則普遍為部分激動劑。這種效能差異與構象平衡的位置密切相關——C1/C2的比例決定了整體激動強度，而激活軌跡的差異則調控G蛋白亞型選擇性。

本研究通過高時空分辨率的活細胞構象監測，揭示了GPCR激活的復雜性與配體特異性。激動劑不僅調控受體活性狀態的穩態分布，還通過獨特的構象變化軌跡影響信號復合物的形成時序與組成。這些發現闡明了配體效能的分子基礎，并為開發靶向特定GPCR激活路徑的藥物提供了新策略。