當DNA復制機遇上“路障”，細胞必須在“精準修復”與“快速繞過”之間做出抉擇。若選擇失誤，基因組不穩(wěn)定性與突變負荷將急劇攀升，驅(qū)動腫瘤發(fā)生與耐藥。然而，調(diào)控這一命運決定的分子“交通燈”長期模糊不清：停滯復制叉究竟如何決定啟用同源重組（HR）進行高保真模板轉(zhuǎn)換，還是啟用易錯性的跨損傷合成（TLS）？Rad51作為HR核心酶，其經(jīng)典功能被認為是結(jié)合單鏈DNA（ssDNA）形成核蛋白纖維，執(zhí)行同源搜索與鏈侵入；但近年哺乳動物研究提示，Rad51還能保護新生DNA免受MRE11、EXO1、DNA2等核酸酶“誤傷”，且該功能不依賴HR下游因子Rad54。令人費解的是，真核Rad51與細菌RecA最大區(qū)別之一在于其對雙鏈DNA（dsDNA）具有顯著親和力，這一“額外技能”究竟為何演化而來？是否正是決定修復通路取向的“隱藏開關”？為回答上述問題，美國加州大學Davis分校Wolf-Dietrich Heyer團隊在釀酒酵母中開展系統(tǒng)研究，相關成果發(fā)表于《Nature Communications》。

作者首先以rad51Δrad54ts雙突變對甲基磺酸甲酯（MMS）極度敏感為背景，通過高拷貝質(zhì)粒隨機突變篩選，捕獲兩株能“逆襲”MMS敏感表型的Rad51突變體：Rad51-E135D（ED）與Rad51-K305N（KN）。將突變原位敲入基因組后，ED突變呈現(xiàn)與rad51Δ相當?shù)腗MS敏感性，KN則僅輕度敏感；兩突變均無法再度抑制rad54Δ的敏感表型，提示其并非簡單繞過Rad54，而是改變修復通路分配。

為揭示機制，作者整合多學科技術：生化層面，純化野生型與突變蛋白，采用電泳遷移率變動（EMSA）、鹽滴定STM、負染電鏡及ATP酶測定，定量比較DNA結(jié)合與纖維形成；細胞生物學層面，利用免疫熒光、染色質(zhì)內(nèi)切酶切割（ChEC）與2D凝膠電鏡，追蹤Rad51在MMS阻滯叉上的招募及姐妹染色單體連接（SCJ）形成；遺傳學層面，通過CAN1正向突變、iDamage單損傷整合及多位點表型互作，評估TLS與模板轉(zhuǎn)換通路的相對貢獻；體外重組體系，重建RPA-Rad51-Rad54介導的D-loop反應，評估鏈侵入活性；同時構建exo1Δ、mms2Δ、rev3Δ、pol30-K127R-K164R（KKRR）等背景，剖析通路交叉。

主要結(jié)果如下：

Rad51突變體分離與MMS敏感性驗證
通過高拷貝抑制篩選獲得ED與KN，二者在染色體水平均無法彌補rad54Δ，卻使細胞對MMS表現(xiàn)出梯度敏感，提示復制叉修復失衡。

rad51-ED與rad51-KN在姐妹染色單體重組中基本正常
直接重復序列報告系統(tǒng)顯示，兩突變體自發(fā)與HO誘導的姐妹染色單體基因轉(zhuǎn)換頻率與野生型無顯著差異，亦不能恢復rad54Δ的缺陷，表明短程HR未受明顯影響。

rad51-ED與rad51-KN在全基因組同源搜索中嚴重受損
D-loop捕獲（DLC）與斷裂誘導復制（BIR）實驗顯示，ED與KN在染色體V-XI間形成D-loop及BIR產(chǎn)物效率分別下降5-10倍，提示長程纖維或基因組尺度搜索受阻。

Rad51-ED與Rad51-KN蛋白對dsDNA結(jié)合顯著減弱
EMSA與STM顯示，野生型Rad51對100bp dsDNA的Kd≈500nM，而兩突變體在100mM NaCl下幾乎無法形成穩(wěn)定復合物；電鏡亦顯示其在1kb dsDNA上形成>200nm長纖維的能力下降≥70%，但對ssDNA親和力僅輕度降低。

Rad51-ED與Rad51-KN ATP酶活性降低但仍能完成D-loop
在200mM NaCl條件下，ED與KN水解ATP速率下降30-50%，與dsDNA結(jié)合缺陷一致；然而，在50-100mM NaCl的D-loop重建實驗中，二者在Rad54輔助下生成D-loop的峰值與野生型相當，說明催化鏈侵入的核心功能仍保留。

Rad51-ED與Rad51-KN喪失保護dsDNA免受核酸酶降解的能力
體外降解實驗顯示，野生型Rad51可抑制Exo1及Sgs1-Dna2對100bp dsDNA的切割≥80%，而ED與KN在4μM濃度下幾乎無保護作用，直接證實dsDNA結(jié)合是“盾牌”功能的基礎。

rad51-ED與rad51-KN與TLS及模板轉(zhuǎn)換突變體呈現(xiàn)協(xié)同敏感
在0.0033%MMS下，ED與rev3Δ、 mms2Δ或pol30-KKRR組合表現(xiàn)出“雪上加霜”的生長缺陷，KN雖單突變耐受，但與上述突變組合亦顯著增敏，提示突變體已將修復負荷強制轉(zhuǎn)向TLS與PCNA-多泛素化依賴的模板轉(zhuǎn)換（推測為叉倒退）。

rad51-ED與rad51-KN顯著提高自發(fā)突變率
CAN1檢測顯示，ED與KN分別使突變率上升9倍與6倍，與rad51Δ、rad54Δ處于同一水平，且依賴Rev3，證明TLS被過度征用。

iDamage單損傷整合揭示TLS比例升高、模板轉(zhuǎn)換下降
在TT(6-4)光產(chǎn)物與N2-dG-AAF損傷模型中，野生型TLS占比約5-17%，模板轉(zhuǎn)換（DA）為余量；rad51Δ使TLS翻倍，ED與KN表現(xiàn)相同趨勢，進一步量化證明通路切換。

Rad51-ED嚴重削弱在MMS阻滯叉上的招募與SCJ形成
ChEC顯示，ED-MN融合蛋白在0.05%MMS處理2h后幾乎不切割基因組DNA，KN-MN切割水平與野生型一致；2D凝膠定量則表明，ED使sgs1Δ背景SCJ積累降至20%，KN降至60%，直接說明dsDNA結(jié)合缺陷導致Rad51無法有效錨定并穩(wěn)定停滯叉。

綜上，作者提出“Rad51-dsDNA結(jié)合是復制叉修復通路分配開關”的新模型：真核Rad51通過高親和力結(jié)合dsDNA，在ssDNA-dsDNA交界處或叉倒退結(jié)構形成“護DNA盾”，阻止Exo1、Dna2-Sgs1等核酸酶過度修剪；一旦該功能因E135D、K305N等突變喪失，復制叉穩(wěn)定性下降，長程HR纖維難以延伸，細胞被迫調(diào)用TLS及Rad5介導的叉倒退通路，雖可解燃眉之急，卻伴隨突變負荷顯著增加。該發(fā)現(xiàn)不僅解釋了真核Rad51為何保留強dsDNA結(jié)合能力這一進化謎題，也為理解BRCA1/2缺失、RAD51-S181P等臨床突變導致基因組不穩(wěn)定與PARP抑制劑耐藥提供了機制線索，提示靶向Rad51-dsDNA界面或調(diào)控其纖維長度可能成為增強腫瘤化療敏感性、降低獲得性突變的新策略。