基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)已經(jīng)證實(shí)精神分裂癥具有高度多基因性，涉及數(shù)百個(gè)常見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)變異。然而，這些通常位于非編碼區(qū)的風(fēng)險(xiǎn)變異如何通過(guò)調(diào)控靶基因(eGenes)的表達(dá)，并最終協(xié)同導(dǎo)致顯著的臨床表型，仍是一個(gè)懸而未決的核心問(wèn)題。傳統(tǒng)的“加性模型”認(rèn)為多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)變異的效應(yīng)簡(jiǎn)單累加，但這難以完全解釋復(fù)雜的疾病病理。科學(xué)家們推測(cè)，不同的風(fēng)險(xiǎn)基因可能通過(guò)影響某些共同的生物學(xué)通路（即產(chǎn)生“匯聚效應(yīng)”）來(lái)發(fā)揮作用，但這種假說(shuō)在人類神經(jīng)元中缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

為了解開(kāi)這個(gè)謎團(tuán)，由PJ Michael Deans和Kayla G. Retallick-Townsley等人領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》上發(fā)表了他們的最新成果。他們利用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)技術(shù)，將來(lái)自健康供體的細(xì)胞定向分化為谷氨酸能神經(jīng)元(iGLUTs)，這些神經(jīng)元被證實(shí)是精神分裂癥遺傳風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵細(xì)胞類型。研究人員首先通過(guò)生物信息學(xué)方法，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組模擬(EpiXcan, PrediXcan)和共定位分析(COLOC)，從大規(guī)模GWAS數(shù)據(jù)中優(yōu)先篩選出21個(gè)與精神分裂癥風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)的eGenes。

研究團(tuán)隊(duì)隨后運(yùn)用了匯集式(Pooled)和陣列式(Arrayed)兩種CRISPR激活(CRISPRa)和RNA干擾(shRNA)技術(shù)，在iGLUTs中分別單獨(dú)或組合地?cái)_動(dòng)這些eGenes的表達(dá)，模擬風(fēng)險(xiǎn)變異帶來(lái)的表達(dá)量變化。通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和批量RNA測(cè)序等尖端技術(shù)，他們精細(xì)描繪了單個(gè)及多個(gè)eGene擾動(dòng)后的下游轉(zhuǎn)錄組變化圖譜。

本研究的關(guān)鍵技術(shù)方法包括：利用PsychENCODE和CommonMind Consortium等腦組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行eGene優(yōu)先篩選；使用慢病毒載體在hiPSC來(lái)源的神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)或iGLUTs中進(jìn)行CRISPRa/shRNA擾動(dòng)；通過(guò)ECCITE-seq技術(shù)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平的多組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組、sgRNA）檢測(cè)；采用METAL進(jìn)行差異表達(dá)基因的薈萃分析；利用貝葉斯雙聚類(Biclustering)和基因富集分析(GSEA)識(shí)別共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和通路；基于Connectivity Map(CMap)進(jìn)行藥物重定位預(yù)測(cè)。研究所用hiPSC系來(lái)自公開(kāi)庫(kù)，部分細(xì)胞系來(lái)源于兒童期發(fā)病精神分裂癥隊(duì)列的對(duì)照個(gè)體。

研究人員發(fā)現(xiàn)，盡管靶向不同的eGene，但其擾動(dòng)所引起的下游差異表達(dá)基因(DEGs)呈現(xiàn)出顯著的“匯聚”現(xiàn)象，即大量基因表現(xiàn)出同方向（以上調(diào)或下調(diào)為主）的協(xié)同變化。通過(guò)無(wú)監(jiān)督的貝葉斯雙聚類分析，他們構(gòu)建了“匯聚網(wǎng)絡(luò)”，這些網(wǎng)絡(luò)中的基因顯著富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等與精神分裂癥病因相關(guān)的生物學(xué)通路。重要的是，eGene之間的功能相似性（特別是與突觸功能或信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的比例）以及它們?cè)诖竽X組織中的表達(dá)相關(guān)性，與網(wǎng)絡(luò)匯聚的強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)。這表明，功能相似的eGene更傾向于調(diào)控相同的下游通路。

為了模擬多基因風(fēng)險(xiǎn)的真實(shí)場(chǎng)景，研究團(tuán)隊(duì)將eGene分為“突觸相關(guān)”、“轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)”和“多功能”三類進(jìn)行組合擾動(dòng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同時(shí)擾動(dòng)多個(gè)eGene時(shí)，其整體轉(zhuǎn)錄組效應(yīng)并非單個(gè)eGene效應(yīng)的簡(jiǎn)單加和。對(duì)于突觸和調(diào)控相關(guān)eGene的組合，分別有16.8%和20.2%的轉(zhuǎn)錄組變化表現(xiàn)出“非加性”（主要是亞加性）效應(yīng)，即組合效應(yīng)的強(qiáng)度低于基于加性模型的預(yù)測(cè)值。這種非加性效應(yīng)與前述的轉(zhuǎn)錄組匯聚性顯著相關(guān)，并且非加性影響的基因同樣富集于精神分裂癥風(fēng)險(xiǎn)基因和突觸功能相關(guān)基因集。這表明，當(dāng)下游通路被一定數(shù)量的eGene擾動(dòng)“飽和”后，額外增加的風(fēng)險(xiǎn)基因擾動(dòng)所產(chǎn)生的邊際效應(yīng)會(huì)減弱。

既然多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因的影響匯聚于有限的通路，那么干預(yù)這些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)可能比逆轉(zhuǎn)單個(gè)風(fēng)險(xiǎn)變異更為高效。研究人員通過(guò)計(jì)算分析，預(yù)測(cè)出能夠逆轉(zhuǎn)關(guān)鍵匯聚網(wǎng)絡(luò)基因表達(dá)特征的藥物，包括anandamide、辛伐他汀(simvastatin)和etomoxir。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，辛伐他汀能夠部分逆轉(zhuǎn)由TMEM219 eGene擾動(dòng)引起的轉(zhuǎn)錄組變化和突觸密度增加。這為通過(guò)靶向共享下游通路來(lái)治療精神分裂癥提供了概念性驗(yàn)證。

本研究通過(guò)精巧的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，首次在人類神經(jīng)元中直接證明了精神分裂癥多基因風(fēng)險(xiǎn)存在顯著的 downstream 匯聚效應(yīng)，并且這種匯聚效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)基因組合作用時(shí)的非加性現(xiàn)象。這為理解多基因疾病的“責(zé)任閾值模型”提供了分子層面的實(shí)驗(yàn)支持，即疾病的發(fā)生可能源于多個(gè)微小效應(yīng)變異對(duì)關(guān)鍵通路的累積影響直至突破閾值。研究成果指出，基于生物學(xué)通路（而不僅僅是全基因組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分）的多基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(PRS)可能更具預(yù)測(cè)效力。更重要的是，研究揭示了“匯聚節(jié)點(diǎn)”作為新型治療靶標(biāo)的潛力，為開(kāi)發(fā)針對(duì)多基因復(fù)雜疾病的“通路導(dǎo)向”而非“基因?qū)�向”的治療策略開(kāi)辟了新的道路。