β-鏈配對靶向RFdiffusion技術(shù)顯著提升親水性蛋白靶點結(jié)合劑的設(shè)計能力

《Nature Communications》：Improved protein binder design using β-pairing targeted RFdiffusion

【字體： 大 中 小 】 時間：2026年01月11日 來源：Nature Communications 15.7

　　

在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，設(shè)計能夠特異性結(jié)合靶標(biāo)蛋白的分子工具和潛在療法一直是科學(xué)家們追求的目標(biāo)。盡管計算方法在蛋白設(shè)計方面取得了顯著進展，但針對親水性蛋白表面的高親和力結(jié)合劑設(shè)計仍然面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。這類表面通常富含氫鍵供體和受體，需要設(shè)計精確互補的極性相互作用，而傳統(tǒng)方法難以實現(xiàn)這種精確匹配。

許多具有重要治療意義的靶標(biāo)蛋白（如細(xì)胞表面受體）含有暴露的邊緣β-鏈，這些結(jié)構(gòu)通常具有非經(jīng)典幾何特征，可減少聚集傾向，但也為設(shè)計特異性結(jié)合劑提供了獨特機會。如何針對這些不規(guī)則邊緣β-鏈開發(fā)通用設(shè)計策略，成為該領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。

針對這一挑戰(zhàn)，Baker實驗室團隊在《Nature Communications》上發(fā)表了創(chuàng)新性研究成果。他們開發(fā)了β-鏈配對靶向RFdiffusion方法，通過界面條件化策略引導(dǎo)蛋白生成過程，成功設(shè)計了針對七個不同靶點的高親和力結(jié)合劑。該方法顯著提高了設(shè)計成功率，獲得的結(jié)合劑表現(xiàn)出優(yōu)異的親和力（pM至nM級）、特異性和穩(wěn)定性，晶體結(jié)構(gòu)驗證證實了設(shè)計準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵技術(shù)方法

研究采用RFdiffusion深度學(xué)習(xí)模型進行蛋白骨架生成，通過界面條件化張量指定結(jié)合劑與目標(biāo)β-鏈的配對關(guān)系。利用ProteinMPNN進行序列設(shè)計，AlphaFold 2進行結(jié)合預(yù)測評估。實驗驗證包括酵母表面展示篩選、表面等離子共振（SPR）測定親和力、圓二色譜分析熱穩(wěn)定性、X射線晶體學(xué)解析復(fù)合物結(jié)構(gòu)。功能實驗涵蓋內(nèi)化檢測、靶向降解和信號通路抑制分析。

β-鏈界面條件化改進結(jié)合劑設(shè)計

研究團隊在RFdiffusion推理階段提供界面條件化信息，指示結(jié)合劑β-鏈與目標(biāo)邊緣β-鏈配對。與僅使用熱點條件化的方法相比，β-鏈界面條件化顯著提高了設(shè)計成功率（9.2% vs 0.98%），并產(chǎn)生了更豐富的結(jié)構(gòu)多樣性。該方法對所有測試靶點均產(chǎn)生成功的硅內(nèi)設(shè)計，而標(biāo)準(zhǔn)方法對兩個靶點（ALK-3和FCRL5）未能產(chǎn)生成功設(shè)計。

設(shè)計模型與生物物理表征

針對七個靶點設(shè)計的結(jié)合劑均表現(xiàn)出高親和力，解離常數(shù)（K_d）從皮摩爾到納摩爾級不等。其中ALK-3bp親和力最高（528 pM），PDGFRabp-7LBF為137 pM，其他結(jié)合劑親和力在1.9 nM至96 nM之間。圓二色譜分析顯示所有結(jié)合劑具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，熔化溫度（T_m）在63.2°C至95°C以上，盡管含有暴露邊緣β-鏈，但均表現(xiàn)出良好的溶液行為。

β-鏈配對結(jié)合劑界面具有靶標(biāo)特異性

交叉結(jié)合實驗證實了設(shè)計結(jié)合劑的高特異性。在1.5μM和200nM濃度下，所有結(jié)合劑僅對設(shè)計靶標(biāo)產(chǎn)生強SPR響應(yīng)，而對其他測試受體無明顯結(jié)合。即使針對結(jié)構(gòu)相似的靶標(biāo)對（如ALK-2/ALK-3、KIT/PDGFRα），結(jié)合劑也表現(xiàn)出嚴(yán)格特異性，這源于不同β-鏈配對氫鍵陣列和額外的非鏈配對相互作用。

KITbp:KIT復(fù)合物結(jié)構(gòu)驗證設(shè)計準(zhǔn)確性

KITbp與KIT結(jié)構(gòu)域1-3的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（2.8 ?分辨率）顯示與計算設(shè)計模型高度一致，全原子RMSD為1.9 ?，骨架原子RMSD為0.98 ?。界面分析發(fā)現(xiàn)21個氫鍵，其中9個來自β-鏈配對相互作用，極性原子占鏈配對界面的65%。KITbp結(jié)合位點與KIT天然配體干細(xì)胞因子（SCF）重疊，飽和濃度SCF可減少99%的KIT庫結(jié)合。

設(shè)計結(jié)合劑的生物學(xué)功能

功能實驗表明設(shè)計結(jié)合劑具有生物學(xué)活性。FCRL5bp可被細(xì)胞內(nèi)化，與EGFRbp融合后可誘導(dǎo)EGFR降解。PDGFRabp-7LBF能有效阻斷PDGF-AA通過Akt和Erk通路的信號激活，對ERK磷酸化（IC₅₀= 19.6 nM）和AKT磷酸化（IC₅₀= 38.25 nM）具有納摩爾級抑制能力。在伴隨研究中，a-CTXbp可有效中和a-CTX，保護小鼠免受致命神經(jīng)毒素攻擊。

研究結(jié)論與意義

本研究開發(fā)的β-鏈配對靶向RFdiffusion方法突破了親水性蛋白表面結(jié)合劑設(shè)計的瓶頸。通過精確匹配目標(biāo)邊緣β-鏈的幾何特征，成功設(shè)計了針對多個重要治療靶點的高親和力、高特異性結(jié)合劑。該方法的核心優(yōu)勢在于能夠利用β-鏈配對有效互補極性表面的大量氫鍵供體和受體，相比主要依賴α-螺旋的設(shè)計策略具有明顯優(yōu)勢。

設(shè)計的結(jié)合劑表現(xiàn)出卓越的特性：高熱穩(wěn)定性（T_m>95°C）、皮摩爾級親和力、嚴(yán)格靶標(biāo)特異性以及良好的溶液行為。晶體結(jié)構(gòu)驗證證實了設(shè)計方法的高精度，為計算方法可靠性提供了有力證據(jù)。功能實驗證明這些結(jié)合劑在細(xì)胞環(huán)境中具有預(yù)期生物學(xué)活性，包括受體內(nèi)化、靶向降解和信號通路抑制等。

該研究的成功證實了深度學(xué)習(xí)蛋白設(shè)計模型生成功能驗證的β-鏈配對界面的能力，顯著擴展了從頭設(shè)計結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)多樣性和可靶向表面范圍。特別是對許多治療相關(guān)靶點（如細(xì)胞表面受體的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域）的開發(fā)具有重要價值，為新型治療干預(yù)措施奠定了基礎(chǔ)。盡管這些結(jié)合劑作為治療分子可能需進一步優(yōu)化，但作為起點為改善親和力、穩(wěn)定性、藥代動力學(xué)等特性提供了優(yōu)秀平臺。

值得注意的是，天然蛋白邊緣β-鏈的不規(guī)則幾何特征可能具有抑制脫靶相互作用的功能，而本研究設(shè)計的高特異性結(jié)合劑支持了這一假設(shè)，并證明通過精確匹配目標(biāo)幾何特征，可以系統(tǒng)靶向天然蛋白的不規(guī)則邊緣β-鏈。這一發(fā)現(xiàn)不僅具有重要應(yīng)用價值，也為理解蛋白-蛋白相互作用的基本原理提供了新見解。