《Nature Communications》：Transcriptomic signature-guided depletion of intermediate alveolar epithelial cells ameliorates pulmonary fibrosis in mice
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本研究針對肺纖維化中過渡性肺泡上皮細(xì)胞的功能未知問題，開發(fā)了RNA傳感介導(dǎo)的蛋白翻譯技術(shù)(CellREADR)，通過特異性識別SPRR1A轉(zhuǎn)錄標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了對Krt8+肺泡分化中間細(xì)胞(ADI)的精準(zhǔn)靶向清除。研究發(fā)現(xiàn)清除這類細(xì)胞可顯著減輕博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，揭示了過渡性上皮細(xì)胞在纖維化中的致病作用，為靶向治療提供了新策略。
肺纖維化是一種以進(jìn)行性肺組織瘢痕形成為特征的致命性疾病，其核心病理機(jī)制在于肺泡上皮再生障礙。近年來單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)技術(shù)揭示了肺損傷修復(fù)過程中存在多種過渡性上皮細(xì)胞狀態(tài)，包括小鼠的Krt8+肺泡分化中間細(xì)胞(ADI)和人類的KRT5-/KRT17+異常基底樣細(xì)胞。然而，這些細(xì)胞在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的具體功能角色仍不明確。
為解決這一科學(xué)問題，Peng等人開發(fā)了一種創(chuàng)新的RNA傳感依賴性蛋白翻譯技術(shù)，能夠特異性靶向并操縱表達(dá)特定轉(zhuǎn)錄組特征的細(xì)胞群體。研究人員通過分析公共單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)Small Proline-Rich Protein 1A(SPRR1A) mRNA是小鼠Krt8+ADI細(xì)胞和人類KRT5-/KRT17+異常基底樣細(xì)胞的共享標(biāo)志物。利用可編程RNA傳感器，研究團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)了對Krt8+ADI細(xì)胞的體內(nèi)特異性標(biāo)記和靶向清除。
該研究發(fā)表于《Nature Communications》，首次證實(shí)了過渡性肺泡上皮細(xì)胞在肺纖維化中的致病性作用。研究人員建立了一套完整的實(shí)驗(yàn)體系：通過AAV6.2FF腺相關(guān)病毒載體遞送系統(tǒng)，將特異性識別Sprr1a mRNA的傳感器序列(sesRNA)與效應(yīng)報(bào)告基因(EGFP)或白喉毒素受體(DTR)連接，實(shí)現(xiàn)了在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中精準(zhǔn)靶向過渡性上皮細(xì)胞。
關(guān)鍵技術(shù)方法包括：RNA傳感器設(shè)計(jì)(CellREADR技術(shù))、腺相關(guān)病毒(AAV)載體構(gòu)建與純化、單細(xì)胞RNA測序分析、RNA熒光原位雜交(FISH)、流式細(xì)胞分選、三維肺泡類器官培養(yǎng)、以及人肺組織樣本的免疫熒光分析。人類肺組織樣本來自阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校的氣道組織獲取項(xiàng)目。
SPRR1A識別Krt8+ADI和異常基底樣細(xì)胞群體
轉(zhuǎn)錄組分析顯示，Sprr1a特異性富集于小鼠Krt8+ADI細(xì)胞，而Krt8表達(dá)則廣泛分布于多種肺細(xì)胞類型。RNA FISH結(jié)合免疫熒光驗(yàn)證了Sprr1a mRNA主要位于Krt8+Sftpc+細(xì)胞，且在Krt8highSftpclow細(xì)胞中表達(dá)更強(qiáng)。人類IPF肺組織分析同樣證實(shí)SPRR1A特異性定位於KRT17+/KRT5-上皮細(xì)胞，確立了SPRR1A作為跨物種過渡性上皮細(xì)胞的可靠標(biāo)志物。
通過Sprr1a-RNA傳感器體內(nèi)標(biāo)記Krt8+ADI細(xì)胞
研究人員設(shè)計(jì)了特異性識別Sprr1a mRNA的傳感器序列，通過AAV6.2FF載體遞送至博來霉素處理的Krt8-Cre;Rosa-tdT小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，EGFP報(bào)告基因表達(dá)與Krt8(tdT+)信號在纖維化肺泡區(qū)域顯著共定位，證實(shí)了Sprr1a傳感器系統(tǒng)能夠特異性靶向Krt8+ADI細(xì)胞。
Sprr1a+與Krt8+ADI細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組比較
單細(xì)胞RNA測序分析表明，EGFP+細(xì)胞高表達(dá)Krt8+ADI狀態(tài)相關(guān)標(biāo)志物(如Krt8、Krt18、Sprr1a、Areg等)。相關(guān)性分析顯示EGFP+與Krt8+ADI細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組水平高度相似(斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)0.81)。UMAP可視化證實(shí)EGFP+細(xì)胞主要富集于Krt8+ADI相關(guān)的Leiden聚類中。
小鼠肺中Sprr1a+細(xì)胞的表型特征
新鮮分離的Sprr1a+細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的衰老樣表型，包括高水平的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)、p21(Cdkn1a)和p53(Tp53)表達(dá)，但p16(Cdkn2a)表達(dá)缺失。三維肺泡類器官培養(yǎng)顯示，Sprr1a+細(xì)胞形成克隆的效率低于正常AT2細(xì)胞，但形成的類體積更大，且約1%的細(xì)胞保持高增殖活性(Ki67+)，提示該群體存在異質(zhì)性。
Sprr1a導(dǎo)向的Krt8+ADI細(xì)胞清除減輕肺纖維化
研究人員在博來霉素?fù)p傷后第8天給予AAV6.2FF-Sprr1a sesRNA-DTR，第14天給予白喉毒素(DT)，成功清除了約38%的過渡性上皮細(xì)胞。這種靶向清除顯著減輕了肺纖維化，表現(xiàn)為膠原沉積減少、羥脯氨酸含量降低以及纖維化標(biāo)志物(膠原蛋白I、纖連蛋白、α平滑肌肌動蛋白)表達(dá)下降。值得注意的是，未接受DT處理的對照組中也有11.8%的Sprr1a+細(xì)胞發(fā)生凋亡，表明這類細(xì)胞在肺損傷修復(fù)過程中存在自然更替。
研究結(jié)論強(qiáng)調(diào)，過渡性肺泡上皮細(xì)胞在肺纖維化發(fā)展中扮演關(guān)鍵致病角色。通過轉(zhuǎn)錄組特征導(dǎo)向的細(xì)胞靶向技術(shù)特異性清除Krt8+ADI細(xì)胞，能夠有效緩解博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。該研究不僅揭示了過渡性上皮細(xì)胞作為肺纖維化治療潛在靶點(diǎn)的重要性，還展示了一種基于scRNA-seq發(fā)現(xiàn)的可轉(zhuǎn)化細(xì)胞靶向策略的強(qiáng)大應(yīng)用潛力。
討論部分進(jìn)一步闡述了過渡性AT2細(xì)胞中瞬時(shí)衰老與永久衰老的狀態(tài)差異，以及其在肺修復(fù)過程中的動態(tài)平衡。研究表明，過渡性AT2細(xì)胞的自然凋亡可能是防止其異常累積的重要內(nèi)在機(jī)制。這種基于RNA傳感的細(xì)胞靶向平臺為研究疾病特定細(xì)胞群體的功能提供了強(qiáng)大工具，并為開發(fā)精準(zhǔn)治療策略開辟了新途徑。
