《Nature Communications》：EPOP restricts PRC2.1 targeting to chromatin by directly modulating enzyme complex dimerization
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本研究針對PRC2.1特異性亞基EPOP在染色質靶向中的抑制性功能謎題，通過結構生物學與功能基因組學手段，揭示EPOP通過直接破壞PRC2.1的二聚化結構削弱其染色質結合能力，從而防止關鍵發(fā)育基因在干細胞分化過程中被過度抑制。該工作為表觀遺傳復合物的構象調控機制提供了新范式。
在生命早期發(fā)育過程中，基因的精確時空調控依賴于復雜的表觀遺傳機制。多梳抑制復合物2（PRC2）作為關鍵的表觀遺傳調控器，通過催化組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化（H3K27me3）標記，建立并維持基因的抑制狀態(tài)。PRC2以兩類不同的全復合物形式存在：PRC2.1和PRC2.2，它們共享核心亞基，但擁有各自特異的輔助亞基。PRC2.1包含EPOP、PALI1/2以及PCL蛋白（PHF1、MTF2、PHF19），而PRC2.2則包含AEBP2和JARID2。盡管PRC2.1和PRC2.2在基因組上的結合位點大量重疊，但它們在細胞分化過程中對基因表達的調控作用存在差異，提示它們可能承擔著非冗余的生物學功能。
在PRC2.1的輔助亞基中，EPOP（ESPRC2p48 / C17orf96）的角色尤為獨特。與其它輔助亞基通常促進PRC2的染色質靶向不同，早期研究提示EPOP可能反而抑制PRC2的功能。例如，在小鼠胚胎干細胞（mESCs）中，EPOP的缺失或敲低會導致PRC2核心亞基SUZ12、PRC2.2亞基JARID2以及H3K27me3在染色質上的富集增加。然而，EPOP發(fā)揮這一抑制性作用的分子機制一直模糊不清。此外，EPOP還能與Elongin BC異源二聚體相互作用，但其在PRC2調控中的必要性也存在爭議。理解EPOP如何精確調控PRC2.1，對于闡明其在早期發(fā)育和細胞命運決定中的作用至關重要。
為了解決這一難題，來自美國德克薩斯大學西南醫(yī)學中心的研究團隊在《Nature Communications》上發(fā)表了他們的研究成果。本研究綜合運用生物化學、結構生物學和基因組學技術，揭示了EPOP通過直接調控PRC2.1全復合物的二聚化狀態(tài)，從而限制其染色質靶向能力的新機制。這一發(fā)現不僅解釋了長期存在的EPOP功能謎題，也為理解表觀遺傳復合物如何通過構象變化精細調控基因表達提供了新的視角。
關鍵技術方法概述
研究人員首先通過基因敲除（KO）技術在E14 mESCs中構建了EPOP缺失細胞系，并利用尺寸排阻色譜（SEC）分析了PRC2復合物的組裝狀態(tài)。他們解析了EPOP C端結構域與PRC2.1亞復合物（包含SUZ12(N)、RBBP4和PHF19的反向染色質域）結合的晶體結構，分辨率達2.7 ?。通過基于結構的突變，他們構建了PRC2結合缺陷的EPOP突變體（EPOPD5）。在功能驗證方面，他們采用了免疫共沉淀（Co-IP）二聚化分析、質譜光度法、電泳遷移率變動分析（EMSA）以及生物素化DNA/核小體pull-down實驗，體外評估了EPOP對PRC2.1二聚化及染色質結合的影響。在體內功能層面，他們在EPOP KO的mESCs中重新表達了野生型（EPOPWT）和突變型（EPOPD5）蛋白，并將這些細胞定向分化為類上胚層細胞（EpiLCs），模擬早期發(fā)育過程。最后，他們利用染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）和RNA測序（RNA-seq）技術，在全基因組范圍內分析了EPOP-PRC2.1相互作用對MTF2、H3K27me3染色質富集及基因表達的直接影響。對于Elongin BC的作用，則通過短發(fā)夾RNA（shRNA）敲低（KD）技術進行研究。
研究結果
EPOP在mESCs中形成獨特的PRC2.1復合物并調控其色譜行為
研究人員發(fā)現，在mESCs中，EPOP與MTF2共同存在于PRC2.1復合物中。當敲除EPOP后，含有MTF2的PRC2.1復合物在尺寸排阻色譜中的洗脫峰向分子量更大的方向偏移，提示其二聚體形式積累增加。而PRC2.2的特異性亞基AEBP2和JARID2的洗脫行為未受影響。這表明EPOP特異性地調控了PRC2.1的分子構象或寡聚化狀態(tài)。
EPOP從結構上破壞含MTF2或PHF19的PRC2.1二聚體
研究的關鍵突破在于解析了EPOP C端結構域與PRC2.1亞復合物的晶體結構。結構分析顯示，EPOP的結合位點與PRC2.2的亞基JARID2和AEBP2存在空間位阻，這解釋了PRC2.1和PRC2.2組裝的互斥性。更重要的是，研究人員之前的工作表明，PHF19（以及同源的MTF2）通過其“二聚穩(wěn)定化”（DS）螺旋作為“分子膠水”，穩(wěn)定了PRC2核心復合物（PRC2core）固有的域交換二聚體界面。而在當前的結構中，EPOP的結合恰好破壞了PHF19的DS螺旋與PRC2core的相互作用，使得二聚體結構變得不穩(wěn)定。這表明EPOP通過一種“解鎖”機制，促使PRC2.1從穩(wěn)定的二聚體狀態(tài)向單體狀態(tài)轉變。
EPOP逐步破壞PRC2.1二聚體
為了驗證結構觀察，研究人員進行了體外二聚化實驗。當在HEK293T細胞中共表達帶有不同標簽（FLAG和Myc）的EZH2以及其他PRC2.1亞基時，可以檢測到PRC2.1MTF2二聚體的形成。然而，當共表達野生型EPOP時，二聚體的形成被顯著抑制，而PRC2結合缺陷的EPOPD5突變體則無此效果。利用質譜光度法對純化的蛋白質復合物進行分析，直接證實了全長EPOPWT（而非EPOPD5）能夠將PRC2.1MTF2從二聚體/單體平衡狀態(tài)轉變?yōu)橹饕詥误w形式存在。尺寸排阻色譜結果進一步表明，EPOP的C端片段僅能部分破壞二聚體，而全長EPOP的效果更顯著，提示EPOP中除C端結構域外的其他非結構化區(qū)域也參與了二聚體到單體的轉變過程。值得注意的是，加入Elongin BC并未對二聚體破壞產生額外影響。
二聚體破壞削弱了PRC2.1的染色質結合
二聚化的PRC2.1被認為可能通過“親合力效應”增強其與染色質的結合。為了驗證EPOP介導的二聚體破壞的功能后果，研究人員進行了一系列體外結合實驗。利用來自小鼠Lhx6基因的CpG島（CGI）DNA作為探針的pull-down實驗顯示，在EPOP KO的mESC核提取物中，有更多的MTF2-PRC2.1被捕獲。電泳遷移率變動分析定量結果表明，PRC2.1MTF2-EPOP全復合物與CGI DNA和核小體的表觀結合親和力（Kd）均顯著低于PRC2.1MTF2二聚體。
具體而言，PRC2.1MTF2結合DNA的Kd為3.4 ± 1.1 nM，而PRC2.1MTF2-EPOP的Kd為9.2 ± 1.8 nM。在核小體結合實驗中，PRC2.1MTF2的Kd為122.9 ± 8.5 nM，而PRC2.1MTF2-EPOP的Kd為295.4 ± 16.4 nM。此外，在凝膠上，DNA或核小體與PRC2.1MTF2形成的超大復合物遷移更慢，體積顯得更大，這與其二聚體性質一致，而與EPOP結合后形成的復合物體積更小，符合單體特征。這些數據強有力地證明，EPOP通過破壞PRC2.1的二聚化，削弱了其與染色質的結合。
EPOP在EpiLCs中賦予PRC2.1獨特的全基因組分布譜
為了在更接近生理狀態(tài)的發(fā)育模型中研究EPOP的直接作用，研究人員將表達EPOPWT或EPOPD5的mESCs定向分化為類上胚層細胞。ChIP-seq分析顯示，與EPOPWT EpiLCs相比，在EPOPD5 EpiLCs中，有2317個MTF2結合位點的信號顯著增強（FDR < 0.05）。同時，在20742個共有區(qū)域中，有5400個區(qū)域的H3K27me3信號也出現增益。這表明，當EPOP無法與PRC2.1結合時，PRC2.1在染色質上的靶向和H3K27me3沉積活性增強，與體外實驗結果一致。
EPOP限制PRC2.1不依賴于Elongin BC
為了闡明Elongin BC在EPOP介導的PRC2.1抑制中的作用，研究人員在EpiLCs中敲低了Elongin B。結果顯示，在Elongin B敲低的情況下，EPOPD5 EpiLCs中MTF2在絕大多數差異結合位點（3251/3259）的富集仍然高于EPOPWT EpiLCs，且這些位點與對照敲低情況下上調的MTF2位點有85.8%的重疊。這表明Elongin BC在很大程度上并不參與EPOP對PRC2.1靶向的抑制。然而，有趣的是，在EPOPWT EpiLCs中，Elongin B的敲低損害了MTF2在一部分基因位點的結合，提示在EpiLCs中，Elongin BC可能通過EPOP依賴的方式在某些位點促進PRC2.1的靶向。
EPOP防止EpiLCs中關鍵發(fā)育基因的過度抑制
RNA-seq分析發(fā)現，在EPOPD5 EpiLCs中，有130個表達下調的基因其轉錄起始位點（TSS）周圍的MTF2和H3K27me3信號顯著增強。基因本體分析顯示，這些被PRC1抑制、但由EPOP維持一定表達水平的基因，顯著富集于序列特異性DNA結合蛋白，包括Rel同源轉錄因子、堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子、翼狀螺旋/叉頭轉錄因子和同源域轉錄因子。這些因子與轉錄調控、干細胞維持和器官發(fā)育等生物學過程相關。值得注意的是，其中一些基因（如Esrrb, Gjb3, Plagl1, Prdm1, Prdm14）在ESC向EpiLC分化過程中被抑制，但在后續(xù)的EpiLC向原始生殖細胞樣細胞分化過程中又被強烈上調。這表明，EPOP通過限制PRC2.1的活性，防止這些關鍵發(fā)育調節(jié)因子在早期分化階段被過早或過度抑制，從而為后續(xù)的細胞命運轉變保留了必要的基因表達程序。
研究結論與意義
本研究系統(tǒng)地闡明了EPOP調控PRC2.1的一種新穎分子機制：EPOP通過直接破壞由MTF2或PHF19穩(wěn)定的PRC2.1二聚體結構，將其轉變?yōu)閱误w，從而削弱其染色質結合能力。這一機制在體外生化實驗和體內EpiLCs模型中均得到了驗證。重要的是，通過使用基于結構設計的PRC2結合缺陷型EPOP突變體，研究清晰地分離了EPOP依賴于PRC2的功能與其可能獨立于PRC2的功能。研究還表明，Elongin BC在此核心抑制機制中并非必需。
該研究的發(fā)現具有多重重要意義：
- 1.
機制新穎性：它揭示了調控重要表觀遺傳復合物功能的一種新范式——通過調節(jié)其寡聚化狀態(tài)來精確控制其活性。這類似于轉錄因子二聚化在轉錄調控中的重要作用，但對于大型表觀遺傳復合物而言，此類調控機制的明確報道尚屬罕見。
- 2.
解決長期謎題：為EPOP這一PRC2.1特異性亞基看似矛盾的抑制性功能提供了直接的分子解釋。
- 3.
發(fā)育生物學意義：提出了EPOP在早期發(fā)育中充當“剎車”的角色模型，通過防止PRC2.1對關鍵發(fā)育調節(jié)因子的過度抑制，確保基因表達譜的平穩(wěn)變化，為后續(xù)細胞命運轉變（如原始生殖細胞特化）創(chuàng)造時間窗口。這有助于理解多能干細胞分化過程中的表觀遺傳精度控制。
- 4.
潛在廣泛性：鑒于EPOP在成年神經系統(tǒng)中高表達，該機制可能同樣適用于神經系統(tǒng)中的基因表達調控。
總之，這項研究不僅深化了我們對PRC2復雜性及其調控的理解，也展示了結構生物學引導的功能研究在破解復雜生物學過程中的強大力量。相關發(fā)現發(fā)表于《Nature Communications》期刊，為表觀遺傳學領域提供了重要的新知。
