《Nature Communications》：Structural basis for late maturation steps of mitochondrial respiratory chain complex IV within the human respirasome
編輯推薦：
本研究針對線粒體呼吸鏈超級復合物（respirasome）組裝機制這一關鍵科學問題，通過冷凍電鏡技術解析了人源CI+CIII2+CIV呼吸體高分辨率結構，首次捕獲了復合物IV（CIV）在其內部的晚期組裝中間態。研究發現HIGD2A作為分子占位符與CIV結合，并在最終成熟步驟中被NDUFA4取代，從而闡明了呼吸體生物發生的有序時空調控機制，為線粒體疾病（如Leigh綜合征）的致病機理提供了新的結構見解。
在真核細胞的能量工廠——線粒體中，一套精密的“發電系統”負責著細胞能量的轉換。這就是位于線粒體內膜上的氧化磷酸化系統，它由四個復雜的蛋白質機器（復合物I到IV，簡稱CI-CIV）和兩個移動的電子載體構成。它們協同工作，將營養物質中的化學能轉化為細胞通用能量貨幣ATP。更為奇妙的是，這些復合物并非總是獨立工作，它們能夠進一步組裝成更高級的超級復合物，其中最為典型的是包含CI、CIII二聚體（CIII2）和CIV的“呼吸體”，它能夠高效地完成從NADH到氧氣的完整電子傳遞鏈反應。
然而，如此復雜的超級復合物是如何被準確組裝起來的，一直是領域內的核心謎題。特別是，它們是像拼裝樂高積木一樣，由預先完全組裝好的單個復合物拼接而成？還是說，在組裝過程中，部分尚未完工的復合物中間體就會提前“找好隊友”，在超級復合物的框架內完成最后的“精裝修”？這個問題不僅關乎我們對生命基本過程的理解，更與人類健康息息相關，因為線粒體呼吸鏈的組裝缺陷會導致一系列嚴重的遺傳性疾病，如Leigh綜合征等腦肌病。
為了解開呼吸體組裝之謎，特別是搞清復合物IV（CIV，又稱細胞色素c氧化酶）這一關鍵部件是如何在呼吸體背景下完成其最后組裝步驟的，由Minh Duc Nguyen和Ana Sierra-Magro作為共同第一作者，Antoni Barrientos和Joanna Rorbach作為共同通訊作者領導的研究團隊，在《Nature Communications》上發表了他們的最新研究成果。他們利用冷凍電鏡這一強大的結構生物學工具，成功解析了從人胚胎腎細胞（HEK293）中分離出的天然CI+CIII2+CIV呼吸體的高分辨率結構，并意外地捕捉到了CIV在呼吸體內的晚期組裝中間狀態。
研究人員主要通過以下幾種關鍵技術方法開展研究：利用基因工程技術構建了帶有FLAG標簽的COX14（一種CIV生物發生因子）的HEK293細胞系，用于后續的蛋白質復合物純化；采用差速離心法從大規模培養的細胞中分離高純度的線粒體；使用去垢劑LMNG溫和地溶解線粒體膜，并通過免疫親和層析技術特異性富集含有COX14-FLAG的蛋白質復合物；利用單顆粒冷凍電鏡技術解析呼吸體及其組成復合物的高分辨率三維結構，并通過三維變異性分析和局部重構等技術深入解析結構的異質性；構建HIGD2A和NDUFA4的基因敲除（KO）細胞系以及利用患者來源的線粒體DNA突變細胞系（143B cybrids），通過藍綠溫和膠電泳（BN-PAGE）、免疫共沉淀、免疫印跡、光譜法酶活測定和極譜法細胞呼吸測量等生物化學和細胞生物學方法，驗證結構發現并探究其功能意義。
結果
人源呼吸體結構的解析
研究人員通過冷凍電鏡獲得了整體分辨率為3.1 ?的CI+CIII2+CIV呼吸體結構。進一步的局部重構將CI、CIII2和CIV的分辨率分別提升至2.9 ?、2.77 ?和3.1 ?。分析發現，CIV部分的密度相對較弱且更具柔性，暗示了其存在結構異質性。
人源復合物I在2.7 ?分辨率下的結構
對CI的聚焦重構得到了2.66 ?分辨率的結構，顯示其處于“活性靜息態”。該高分辨率模型允許研究人員精確構建了14個常見磷脂分子，并觀察到了NDUFS2亞基的精氨酸甲基化和NDUFS7亞基的絲氨酸磷酸化等新的翻譯后修飾。
人源復合物III在2.5 ?分辨率下的結構
這是目前分辨率最高的人源CIII結構（2.5 ?）。該結構清晰地展示了血紅素bH、bL、c1以及泛醌（UQ）結合位點，但由于構象異質性，未能觀察到Rieske鐵硫蛋白（RISP）中的鐵硫簇清晰密度。
HIGD2A和NDUF4A結合的復合物IV中間體結構
對CIV的深入分析揭示了關鍵發現。通過三維分類，研究人員識別出四種不同的CIV狀態，清晰地展示了HIGD2A和NDUFA4在CIV上一個部分重疊的結合位點上的動態交替過程。其中一類結構顯示HIGD2A結合在由COX1、COX3和COX6A1形成的裂隙中；另一類則顯示NDUFA4占據了該位置；還有兩類中間狀態則同時顯示出HIGD2A的密度和即將結合的或已部分結合的NDUFA4密度。免疫共沉淀實驗證實，HIGD2A和NDUFA4確實都能與呼吸體形式的CIV發生相互作用，并且有少量二者共存于同一顆粒中，支持了冷凍電鏡觀察到的中間態。
HIGD2A結合的復合物IV的結構特征
在HIGD2A結合的狀態下（分辨率2.93 ?），研究人員解析了HIGD2A的結構，其C端結構域與COX3通過保守的QRRQ基序（特別是Arg80, Arg82, Gln86）與COX3上的His149, Asp246, His250發生特異性相互作用。HIGD2A通過疏水和范德華力與COX3及COX6A1相互作用。結構中還觀察到一個心磷脂（CDL）分子對維持復合物結構完整性可能起重要作用。
NDUFA4結合的復合物IV的結構
在NDUFA4結合的狀態下（分辨率3.2 ?），NDUFA4的一個跨膜螺旋與COX1和COX2的跨膜螺旋平行，其結合穩定了上述心磷脂分子。功能實驗表明，敲除NDUFA4會導致CIV酶活性和細胞的內源性呼吸速率下降約50%。對線粒體疾病患者來源的細胞系（COX1, COX2, COX3突變）的分析顯示，NDUFA4只出現在完全組裝的CIV中，而不存在于任何CIV亞組裝體中，證實了NDUFA4是在CIV組裝最后階段被整合的。
HIGD2A和NDUFA4向CIV的層級式整合
生化實驗有力地支持了結構觀察到的置換模型。在HIGD2A敲除細胞中，NDUFA4的水平與其他CIV亞基同步下降。相反，在NDUFA4敲除細胞中，HIGD2A從原本富集的50-kDa調控復合體中重新分布，更多地積聚在完全組裝的游離CIV和呼吸體形式的CIV中，定量分析顯示積累增加了2-3倍。在野生型細胞中，過表達HIGD2A會減少NDUFA4與CIV的結合，反之亦然。在HIGD2A敲除細胞中，過表達NDUFA4能部分挽救CIV的組裝和活性；而在NDUFA4敲除細胞中過表達HIGD2A則對細胞有害。這些數據共同支持了一個模型：HIGD2A作為占位因子，在CIV組裝早期協助COX3模塊整合后，暫時停留在其結合位點上，防止NDUFA4過早結合；隨后，NDUFA4整合進來，置換出HIGD2A，從而完成CIV以及整個呼吸體的最終成熟。
結論與討論
這項研究通過高分辨率結構生物學和系統的生化分析，揭示了人源呼吸體CI+CIII2+CIV生物發生的最終步驟，特別是闡明了CIV在其內部的晚期組裝機制。研究首次在結構上捕獲了HIGD2A作為分子占位符與呼吸體中的CIV結合，并最終被結構性亞基NDUFA4所取代的動態過程。這一發現完善了呼吸體協作組裝的模型，表明呼吸體的組裝并非簡單地拼接成熟復合物，而是可以作為一個平臺，促進其成員復合物（尤其是CIV）的最終成熟。
該研究具有重要的生理和病理意義。首先，它為理解由NDUFA4突變引起的線粒體疾病（如Leigh綜合征）提供了分子病理機制：NDUFA4的缺失并非完全破壞呼吸體組裝，而是阻礙了CIV的功能性成熟，導致其活性顯著降低，進而影響整體能量代謝。其次，研究提出了HIGD2A作為“分子計時器”的新功能，它不僅確保組裝過程的有序進行，還可能為細胞在應激條件下的快速適應提供了可能。NDUFA4存在組織特異性或條件特異性異構體（如缺氧誘導的NDUFA4L2），HIGD2A在部分CIV上的占位，可能為這些異構體在特定情況下的快速替換預留了接口，從而精細調控CIV的活性以適應不同的代謝需求。
總之，這項工作不僅解答了呼吸體組裝過程中一個長期存在的具體問題，更重要的是，它展示了一種通過占位符控制蛋白質復合物組裝順序和質量控制的普適性機制，為未來干預線粒體功能障礙相關疾病提供了新的潛在靶點和思路。
