《Scientific Reports》：Aluminum adjuvants differentially induce IL-1β release in vitro yet share NLRP3 inflammasome-independent adjuvant effects in vivo
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本研究系統(tǒng)比較了氫氧化鋁（AH）與磷酸鋁（AP）佐劑的免疫激活機(jī)制差異。研究人員發(fā)現(xiàn)AP在體外能更高效激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)IL-1β成熟釋放并誘發(fā)細(xì)胞膜破裂，但通過(guò)基因敲除和抑制劑實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這兩種鋁佐劑在小鼠體內(nèi)的抗體增強(qiáng)效應(yīng)均不依賴(lài)NLRP3通路。該研究揭示了鋁佐劑作用機(jī)制的冗余性，為疫苗佐劑研發(fā)提供了重要理論依據(jù)。
在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，鋁佐劑作為使用歷史最悠久的人類(lèi)疫苗佐劑，其神秘的作用機(jī)制至今仍是免疫學(xué)家們探索的熱點(diǎn)。盡管氫氧化鋁（AH）和磷酸鋁（AP）這兩種主要的鋁佐劑在物理化學(xué)特性上存在顯著差異——AH呈針狀納米顆粒帶正電，AP為片狀納米顆粒帶負(fù)電——但它們?cè)谡鎸?shí)世界中引發(fā)的免疫效果卻頗為相似。這種表觀相似性背后是否隱藏著不同的細(xì)胞激活機(jī)制？特別是圍繞NLRP3炎癥小體在鋁佐劑作用中的爭(zhēng)議，更是科學(xué)界亟待厘清的關(guān)鍵問(wèn)題。
早期研究對(duì)NLRP3炎癥小體在鋁佐劑效應(yīng)中的作用莫衷一是：有些報(bào)道認(rèn)為缺乏NLRP3會(huì)降低抗原特異性IgG1抗體水平，另一些研究則未觀察到這種差異。這些矛盾結(jié)果可能源于實(shí)驗(yàn)條件的差異，包括小鼠品系、鋁佐劑類(lèi)型和劑量、抗原特性以及免疫途徑的不同。更值得注意的是，大多數(shù)前期研究集中于AH或非藥用級(jí)鋁佐劑，而對(duì)AP的研究相對(duì)匱乏，且缺乏對(duì)肌肉注射途徑（人類(lèi)疫苗最常用途徑）的系統(tǒng)評(píng)估。
為了解開(kāi)這些謎團(tuán)，Purdue大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了一項(xiàng)系統(tǒng)研究。他們?cè)凇禨cientific Reports》上發(fā)表的論文揭示了一個(gè)令人驚訝的現(xiàn)象：盡管AP在體外能誘導(dǎo)更強(qiáng)的NLRP3炎癥小體激活和IL-1β釋放，但兩種鋁佐劑在小鼠體內(nèi)均通過(guò)NLRP3非依賴(lài)性機(jī)制發(fā)揮佐劑效應(yīng)。
研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用了多種關(guān)鍵技術(shù)方法：通過(guò)體外培養(yǎng)人THP-1巨噬細(xì)胞和小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDMs）及樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDCs），采用ELISA和Western blot分析細(xì)胞因子釋放；利用Nlrp3-/-基因敲除小鼠和NLRP3特異性抑制劑MCC950進(jìn)行功能驗(yàn)證；通過(guò)免疫熒光觀察ASC斑點(diǎn)形成；并采用肌肉注射途徑評(píng)估小鼠對(duì)抗原的抗體應(yīng)答。
AP誘導(dǎo)更強(qiáng)的IL-1β釋放且依賴(lài)NLRP3
研究人員發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（LPS）預(yù)刺激的人THP-1巨噬細(xì)胞、小鼠BMDMs和BMDCs中，AP誘導(dǎo)的IL-1β釋放量顯著高于AH。這種差異在24小時(shí)和48小時(shí)的培養(yǎng)中均持續(xù)存在，排除了動(dòng)力學(xué)因素的可能。通過(guò)NLRP3抑制劑MCC950處理和Nlrp3-/-細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，團(tuán)隊(duì)確認(rèn)了兩者誘導(dǎo)的IL-1β釋放均嚴(yán)格依賴(lài)NLRP3。
Western blot分析揭示了更深層次的機(jī)制差異：AP處理不僅導(dǎo)致更多成熟IL-1β（17 kDa）釋放，還引起更多pro-IL-1β（31 kDa）、pro-caspase-1和ASC單體溢出至細(xì)胞上清。有趣的是，在Nlrp3-/-細(xì)胞中，AP仍能誘導(dǎo)這些蛋白的釋放，表明存在NLRP3非依賴(lài)性的細(xì)胞損傷機(jī)制。
AP引發(fā)更顯著的細(xì)胞損傷和膜破裂
劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示，AP在誘導(dǎo)乳酸脫氫酶（LDH）釋放和IL-1β分泌方面均表現(xiàn)出比AH更強(qiáng)的劑量依賴(lài)性。即使在最低測(cè)試濃度（11 μg Al3+/mL），AP也能觸發(fā)可檢測(cè)的IL-1β釋放，而AH在此劑量下幾乎無(wú)效果。
時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明：AP在刺激2小時(shí)后即誘導(dǎo)IL-1β釋放，而此時(shí)LDH釋放尚不明顯；至24小時(shí)，IL-1β釋放大幅增加并伴隨顯著LDH釋放。通過(guò)使用甘氨酸和蠅蕈醇（muscimol）抑制NINJ1介導(dǎo)的膜破裂，研究人員證實(shí)鋁佐劑確實(shí)通過(guò)此途徑導(dǎo)致細(xì)胞損傷，而維持膜完整性有助于保留pro-IL-1β在細(xì)胞內(nèi)。
體內(nèi)抗體應(yīng)答不依賴(lài)NLRP3
盡管體外實(shí)驗(yàn)顯示AP具有更強(qiáng)的炎癥小體激活能力，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)卻得出意外結(jié)果。研究人員采用兩種遺傳背景不同的小鼠（近交系C57BL/6J和遠(yuǎn)交系CD-1），通過(guò)肌肉注射途徑評(píng)估抗體應(yīng)答。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是Nlrp3-/-基因敲除小鼠還是MCC950處理的野生型小鼠，其對(duì)鋁佐劑疫苗的抗體應(yīng)答均與對(duì)照組無(wú)顯著差異。這一結(jié)果在兩種抗原（卵清蛋白和SARS-CoV-2核蛋白）和兩種鋁佐劑（AH和AP）中均得到驗(yàn)證，強(qiáng)有力地證明鋁佐劑的免疫增強(qiáng)作用不依賴(lài)NLRP3炎癥小體。
研究結(jié)論與意義
本研究系統(tǒng)闡明了AH和AP在激活先天免疫機(jī)制上的異同：雖然AP在體外誘導(dǎo)更強(qiáng)的NLRP3依賴(lài)性IL-1β釋放和細(xì)胞損傷，但兩種佐劑在體內(nèi)均通過(guò)冗余機(jī)制發(fā)揮佐劑效應(yīng)。這種冗余性可能源于多種替代傳感器的協(xié)同作用，如中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶對(duì)pro-IL-1β的細(xì)胞外加工，以及其他危險(xiǎn)信號(hào)感知通路。
該研究的發(fā)現(xiàn)對(duì)疫苗學(xué)領(lǐng)域具有重要啟示：首先，它解釋了為何針對(duì)特定炎癥小體成分的遺傳變異或藥理抑制通常不影響鋁佐劑疫苗的效果；其次，它強(qiáng)調(diào)了鋁佐劑通過(guò)多機(jī)制網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用的穩(wěn)健性，這可能是其廣泛應(yīng)用和安全性的基礎(chǔ)；最后，研究提醒我們?cè)趯Ⅲw外機(jī)制研究結(jié)果外推至體內(nèi)情況時(shí)需要謹(jǐn)慎，特別是對(duì)于鋁佐劑這類(lèi)通過(guò)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機(jī)制作用的物質(zhì)。
這項(xiàng)研究不僅解決了鋁佐劑領(lǐng)域長(zhǎng)期存在的爭(zhēng)議，也為未來(lái)佐劑設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供了重要理論基礎(chǔ)，證實(shí)了先天免疫系統(tǒng)的強(qiáng)大冗余能力足以在缺乏特定傳感器的情況下維持有效的免疫應(yīng)答。
