《Scientific Reports》：A standardized approach for the isolation of vascular smooth muscle cells from carotid atherosclerotic plaques
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本研究針對頸動脈粥樣硬化研究中血管平滑肌細胞(VSMC)分離存活率低的技術瓶頸，開發了優化的酶消化法。通過單細胞RNA測序(scRNA-seq)驗證，該方法成功獲得高活性VSMC，并揭示其從收縮型經泡沫細胞樣/炎性合成狀態向成纖維細胞樣表型轉換的動態軌跡，為探究斑塊不穩定性機制提供了關鍵技術平臺。
在腦血管疾病研究領域，頸動脈粥樣硬化始終是導致心腦血管事件的重要病理基礎。特別是發生在頸內動脈的不穩定斑塊，因其易破裂特性而成為缺血性卒中的主要誘因。斑塊內部的細胞動態，尤其是血管平滑肌細胞(VSMC)的生物學行為，在動脈粥樣硬化發生發展中扮演著關鍵角色。這些細胞不僅參與斑塊纖維帽的形成與維持，更在病理刺激下發生深刻的表型轉換，從分化的收縮狀態轉變為合成、炎癥甚至巨噬細胞樣狀態，直接影響斑塊的穩定性。
然而，深入研究VSMC在動脈粥樣硬化中的作用面臨重大技術挑戰。人體動脈粥樣硬化斑塊組織具有高度異質性，包含大量鈣化區域、脂質核心和纖維化組織，使得從中高效分離具有活性的VSMC變得異常困難。傳統分離方法往往獲得細胞數量有限、存活率低，難以滿足現代細胞生物學研究，特別是單細胞分析的技術要求。這一技術瓶頸嚴重制約了科研人員對VSMC在動脈粥樣硬化中生物學行為的深入理解。
為了突破這一限制，由麥吉爾大學健康中心研究所血管健康單元的Jae Hyun Byun、Stella S. Daskalopoulou等研究人員組成的團隊，在《Scientific Reports》上發表了他們的最新研究成果。他們開發并優化了一套從人頸動脈粥樣硬化斑塊中分離VSMC的標準化流程，并通過單細胞轉錄組學技術全面驗證了分離細胞的純度、活性和生物學相關性。
關鍵技術方法概述
本研究招募了接受頸動脈內膜切除術的患者，獲取斑塊組織后迅速處理。研究人員優化了酶消化配方，采用膠原酶II型、彈性蛋白酶和DNase I的組合，對去除鈣化區域的斑塊組織進行消化，隨后過濾、離心獲得細胞懸液。原代細胞培養至第一代后，使用10X Genomics Chromium平臺進行單細胞RNA測序。數據分析采用Seurat軟件進行質控、整合和聚類，通過Harmony算法整合多樣本數據，利用Monocle 3進行偽時間軌跡分析，并通過Tabula Sapiens血管數據集進行細胞類型注釋驗證。
研究結果
優化的頸動脈斑塊酶消化方案
研究團隊對原有適用于健康血管的VSMC分離方法進行了重要優化，特別針對動脈粥樣硬化斑塊的纖維化、鈣化和脂質豐富的特點調整了技術參數。他們使用來自男性和女性患者的穩定和不穩定斑塊各兩個，驗證了方法的普適性。關鍵改進包括使用膠原酶II型替代I型、添加DNase I以減少細胞聚集、延長消化時間至3小時，這些調整顯著提高了從復雜斑塊組織中獲取單細胞懸液的效率和細胞存活率。
血管平滑肌細胞原代培養
經過優化的消化流程后，細胞在培養瓶中生長良好，約10天可達80-100%融合度。顯微鏡下觀察顯示，分離的細胞呈現典型的VSMC形態——細長紡錘形，細胞核位于中央，與文獻報道的VSMC形態特征一致。這些細胞在傳代一代后用于后續的單細胞轉錄組分析。
單細胞轉錄組分析確認VSMC為主要分離細胞群體
質控過濾后，四個斑塊樣本共有23,661個細胞進入后續分析。通過計算經典VSMC標志物(TAGLN、ACTA2、MYH11、CNN1、MYL9)的模塊評分，發現絕大多數細胞表現出陽性評分，支持其VSMC身份�；虮倔w富集分析顯示，這些細胞顯著富集于VSMC相關的生物學過程，如細胞黏附正調控和細胞外基質組織。進一步通過Tabula Sapiens血管數據集進行細胞類型預測，確認VSMC是主要細胞群體(其次是成纖維細胞)。值得注意的是，成纖維細胞注釋可能反映了VSMC表型轉換而非外膜成纖維細胞污染，因為頸動脈內膜切除術通常不包含外膜組織。
亞群分析揭示多樣化的VSMC相關表型和活躍的表型轉換
考慮到VSMC在動脈粥樣硬化斑塊中的已知可塑性，研究人員深入探討了分離后細胞中是否保留轉錄 distinct的VSMC特征。聚類分析識別出四個轉錄 distinct的VSMC亞群：高表達COL1A1、FN1、COL3A1的成纖維細胞樣VSMC(集群0)；表達S100A4、SERPINE1、CTGF等炎癥基因的合成表型VSMC(集群1)；高表達TAGLN、CALD1、MYL9等收縮標志物的靜息收縮型VSMC(集群2)；以及高表達APOE、SPP1、CCL2等脂質處理和吞噬相關基因的泡沫細胞樣VSMC(集群3)。
偽時間軌跡分析揭示VSMC表型轉換路徑
為探究這些亞群之間的潛在轉換關系，研究人員進行了偽時間軌跡分析。以前期研究為參照，將軌跡根節點設于收縮型VSMC集群，結果顯示細胞沿連續軌跡分布：從收縮型VSMC開始，向泡沫細胞樣和炎性合成表型(中間狀態)進展，最終抵達軌跡末端的成纖維細胞樣狀態。這一軌跡結構表明，成纖維細胞樣細胞是通過逐漸獲得合成、炎癥和脂質處理特征而從收縮型VSMC演化而來，支持VSMC表型轉換的概念，而非外膜成纖維細胞污染。
研究結論與意義
本研究成功建立了一套高效、標準化的方法，用于從人頸動脈粥樣硬化斑塊中分離高存活率的VSMC。通過單細胞轉錄組學分析，不僅驗證了分離細胞的主要成分為VSMC，還揭示了其在體外培養中仍保持多種功能狀態，包括收縮型、合成型、炎癥型、泡沫細胞樣和成纖維細胞樣表型。更重要的是，偽時間軌跡分析直觀展示了VSMC從收縮狀態經中間狀態向成纖維細胞樣狀態轉變的動態過程，為理解VSMC在動脈粥樣硬化中的可塑性提供了直接證據。
這一技術的建立具有多重意義：方法學上，通過優化酶組合和消化條件，顯著提高了從復雜病變組織中獲得高質量VSMC的效率；科學上，證實了即使經過短期培養，斑塊來源的VSMC仍保留其在體內的表型特征和轉換潛能，為利用原代細胞進行疾病建模奠定了基礎；臨床上，為研究VSMC表型轉換與斑塊不穩定性的關系提供了可靠平臺，有助于未來發現新的治療靶點。
該協議的成功優化使得從有限的人斑塊樣本中獲得高質量VSMC成為可能，為心血管研究領域提供了寶貴的技術資源。未來研究可結合功能實驗深入探討不同VSMC表型在動脈粥樣硬化進展中的具體作用機制，以及它們作為治療靶點的潛在價值。
