在大腦的深處，一個(gè)名為黑質(zhì)致密部的微小區(qū)域，其多巴胺神經(jīng)元的進(jìn)行性喪失是帕金森病（Parkinson's disease, PD）的核心病理特征。除了眾所周知的α-突觸核蛋白（α-Synuclein, α-Syn）聚集形成的路易小體，科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)帕金森病患者的大腦，特別是黑質(zhì)區(qū)域，存在明顯的鐵異常積聚。鐵是生命活動(dòng)不可或缺的元素，但過(guò)量的鐵會(huì)通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，甚至觸發(fā)一種鐵依賴性的新型細(xì)胞死亡——鐵死亡（ferroptosis），這可能是推動(dòng)帕金森病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而，長(zhǎng)期以來(lái)，帕金森病中鐵為何會(huì)異常積聚，其背后的分子機(jī)制一直籠罩在迷霧之中。

一些罕見(jiàn)的遺傳性帕金森病病例為揭開(kāi)謎底提供了線索。其中，PARK9型（又稱Kufor-Rakeb綜合征）是由ATP13A2基因突變引起，該病被歸類為伴有腦鐵積聚的神經(jīng)退行性疾病（Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation, NBIA）。ATP13A2是一種位于溶酶體膜上的P型ATP酶，對(duì)維持溶酶體的正常功能至關(guān)重要。那么，一個(gè)溶酶體蛋白的缺陷，是如何導(dǎo)致鐵在細(xì)胞內(nèi)“庫(kù)存積壓”的呢？這成為了一個(gè)亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。

近期，發(fā)表在《Scientific Reports》上的一項(xiàng)研究，正是瞄準(zhǔn)了這一關(guān)鍵問(wèn)題。由日本岐阜藥科大學(xué)Masatoshi Inden博士領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)，利用細(xì)胞模型深入探究了ATP13A2功能缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)失衡的精細(xì)機(jī)制。他們的研究繪制出了一條從溶酶體功能障礙到線粒體損傷，最終破壞鐵穩(wěn)態(tài)的完整通路，為理解帕金森病及其他腦鐵積聚疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論框架。

本研究主要使用了人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞及其穩(wěn)定過(guò)表達(dá)人野生型α-突觸核蛋白的細(xì)胞系（a-Syn-SH細(xì)胞）。通過(guò)小干擾RNA（siRNA）技術(shù)敲低ATP13A2或PINK1基因的表達(dá)以構(gòu)建疾病模型。研究關(guān)鍵性地應(yīng)用了一系列先進(jìn)的化學(xué)熒光探針，包括：檢測(cè)胞質(zhì)Labile Fe²⁺的RhoNox-4、靶向線粒體Fe²⁺的MtFluNox、靶向溶酶體Fe²⁺的HM-RhoNox-M以及檢測(cè)線粒體Labile Heme的AcH-FluNox，實(shí)現(xiàn)了對(duì)亞細(xì)胞水平鐵和血紅素動(dòng)態(tài)的高分辨率實(shí)時(shí)成像。此外，還采用了原子吸收光譜法定量總鐵含量、Seahorse細(xì)胞能量代謝分析系統(tǒng)評(píng)估線粒體呼吸功能、免疫印跡（Western blot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析蛋白及mRNA表達(dá)、以及商品化試劑盒檢測(cè)線粒體自噬等關(guān)鍵技術(shù)。

研究人員首先在a-Syn-SH細(xì)胞中成功敲低了ATP13A2的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATP13A2缺陷導(dǎo)致溶酶體pH值升高，表明其酸化功能受損。同時(shí)，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II和p62的蛋白水平顯著積累，提示自噬流（autophagic flux）被阻斷。這些結(jié)果證實(shí)了ATP13A2缺失確實(shí)損害了溶酶體功能，進(jìn)而影響了細(xì)胞的自噬降解能力。

通過(guò)原子吸收光譜和特異性熒光探針檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)ATP13A2敲低細(xì)胞的總體鐵含量和胞質(zhì)內(nèi)的不穩(wěn)定Fe²⁺水平均顯著升高。更精細(xì)的亞定位分析顯示，這些多余的Fe²⁺不僅存在于胞質(zhì)，在線粒體和溶酶體中也出現(xiàn)了明顯的積聚。作為細(xì)胞的鐵儲(chǔ)存蛋白，鐵蛋白（Ferritin）的水平也隨之增加。這種鐵的異常累積帶來(lái)了功能性后果：線粒體活性氧（ROS）水平升高，細(xì)胞存活率下降。而使用鐵螯合劑去鐵胺（Deferoxamine, DFO）或鐵死亡抑制劑（Ferrostatin-1）處理，能夠緩解氧化應(yīng)激并提高細(xì)胞存活率，證明鐵依賴性毒性是細(xì)胞損傷的重要原因。

在正常細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)鐵水平受到精細(xì)的反饋調(diào)節(jié)。鐵調(diào)節(jié)蛋白2（Iron Regulatory Protein 2, IRP2）是核心調(diào)控因子。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵充足時(shí)，IRP2會(huì)被血紅素依賴性機(jī)制降解，從而導(dǎo)致鐵輸入蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體Transferrin Receptor, TfR和二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體1 Divalent Metal Transporter 1, DMT1）的mRNA穩(wěn)定性下降，減少鐵攝入。然而，在本研究中，盡管細(xì)胞內(nèi)鐵已經(jīng)超載，ATP13A2敲低細(xì)胞中的IRP2蛋白水平卻未相應(yīng)降低，TfR和DMT1的mRNA和/或蛋白表達(dá)反而異常升高，鐵輸出蛋白Ferroportin（FPN）則無(wú)變化。這表明，細(xì)胞感知鐵水平并做出適應(yīng)性反應(yīng)的“剎車(chē)”系統(tǒng)——IRP2調(diào)控通路失靈了。

為了驗(yàn)證鐵流入過(guò)多是導(dǎo)致細(xì)胞毒性的直接原因，研究人員使用了無(wú)鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（apo-Transferrin）競(jìng)爭(zhēng)性抑制TfR介導(dǎo)的鐵攝取，以及格列本脲（Glibenclamide）抑制DMT1活性。結(jié)果表明，這兩種干預(yù)措施均能有效降低ATP13A2敲低細(xì)胞中的總鐵和不穩(wěn)定Fe²⁺水平，減輕線粒體氧化應(yīng)激，并顯著改善細(xì)胞活力。這證明靶向鐵流入途徑確實(shí)具有保護(hù)作用。

ATP13A2位于溶酶體，其缺陷是如何影響IRP2的呢？研究人員將目光投向了線粒體。他們發(fā)現(xiàn)ATP13A2敲低細(xì)胞存在線粒體自噬（mitophagy）缺陷，并且線粒體功能全面受損，包括基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸、ATP產(chǎn)生量和備用呼吸容量均下降。更重要的是，使用AcH-FluNox探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在給予血紅素合成前體5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）后，ATP13A2敲低細(xì)胞的線粒體血紅素合成能力顯著低于對(duì)照組。已知IRP2的降解依賴于血紅素。因此，線粒體功能障礙導(dǎo)致的血紅素合成不足，很可能是IRP2無(wú)法被有效降解、鐵穩(wěn)態(tài)反饋調(diào)節(jié)失靈的根本原因。在PINK1敲低（另一個(gè)導(dǎo)致線粒體自噬缺陷的帕金森病相關(guān)基因）細(xì)胞模型中，也觀察到了類似的Fe²⁺積聚和血紅素合成能力下降的現(xiàn)象，支持了這一機(jī)制的普適性。

這項(xiàng)研究成功地解析了ATP13A2缺陷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵積聚的因果鏈條：ATP13A2缺失→溶酶體功能障礙→自噬/線粒體自噬受損→功能障礙線粒體累積→線粒體功能全面下降（包括呼吸功能和血紅素合成能力）→血紅素合成不足→IRP2降解受阻→TfR/DMT1表達(dá)失控→鐵持續(xù)流入→鐵超載（尤其在線粒體和溶酶體）→氧化應(yīng)激/鐵死亡→細(xì)胞損傷。這是一個(gè)由溶酶體缺陷觸發(fā)，進(jìn)而波及線粒體，最終破壞整個(gè)細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)的惡性循環(huán)。

該研究的重大意義在于：首先，它首次將帕金森病中溶酶體、線粒體和鐵代謝這三條關(guān)鍵病理通路有機(jī)地聯(lián)系起來(lái)，提供了一個(gè)整合性的疾病機(jī)制模型。其次，研究揭示了線粒體血紅素合成能力在維持鐵穩(wěn)態(tài)中的核心作用，以及其失調(diào)在神經(jīng)退行性疾病中的新角色。最后，研究結(jié)果表明，直接抑制鐵流入（如靶向TfR或DMT1）或改善線粒體功能以促進(jìn)血紅素合成，可能成為治療PARK9乃至其他伴有腦鐵積聚的神經(jīng)退行性疾病的新策略，為未來(lái)的藥物開(kāi)發(fā)指明了潛在方向。