《Scientific Reports》：Epithelial remodeling and microbial dysbiosis in the lower respiratory tract of vitamin A-deficient mouse lungs
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本研究針對維生素A缺乏(VAD)如何影響肺部穩態這一關鍵科學問題，通過構建VAD小鼠模型，綜合運用形態計量學與宏轉錄組學技術，揭示了VAD通過引起氣道上皮重塑（包括上皮剝脫、局灶性增生、纖毛功能喪失）和粘液纖毛清除(MCC)功能受損，導致肺部微生物失調（細菌多樣性增加、有益真菌Ascomycota減少）并促進生物膜形成。該研究為理解營養-宿主-微生物互作在呼吸系統疾病中的作用提供了新機制，對防治營養不良相關肺部感染具有重要意義。
在世界范圍內，維生素A缺乏(VAD)被世界衛生組織確定為低收入社區和發展中國家面臨的重大公共衛生問題。大量研究表明，膳食維生素A缺乏會導致多種肺部病變。長期以來，肺部曾被認為是一個無菌環境，但現有研究證實健康肺部存在短暫的微生物群落，而這些微生物群落在營養不良、呼吸道感染和疾病患者中常常出現失調。由于無法在人類致病內型中解析維生素A介導的機制與其他代謝機制，以及缺乏關于VAD如何影響肺部微生物組的研究數據，成為該領域的一個重要空白。
為了應對這一未滿足的需求，研究人員比較了分子、宏轉錄組和形態計量學數據，以確定膳食VAD如何影響肺部及肺部微生物組。發表在《Scientific Reports》的這項研究顯示，與維生素A充足(VAS)的肺部相比，VAD肺部在宿主-微生物-飲食相互作用方面發生了結構和功能改變；這些變化與上皮重塑、粘液纖毛清除功能崩潰、微生物失衡以及經過8周維生素A缺乏飲食后微生物定植模式改變相關。這些發現證實維生素A對肺部穩態至關重要，并提供了可能對預防呼吸道感染和疾病有價值的機制見解。
為了開展這項研究，研究人員主要應用了幾個關鍵技術方法：他們建立了野生型C57BL/6J小鼠模型，通過8周的膳食調制（VAS vs VAD飲食）誘導維生素A缺乏狀態；開發了一種新穎的混合宿主-微生物RNA提取方案，結合了GentleMACS?組織解離、Qiashredder?組織破碎和PureLink? RNA提取技術的優點，以獲得高質量的宿主和微生物RNA；利用Illumina NextSeq2000進行高通量總RNA測序，并對小鼠rRNA進行去除以增加微生物組測序深度；采用免疫組織化學和免疫熒光技術可視化關鍵蛋白表達（如CC10、FOXJ1、TUBB4A、Ki-67）；通過體外纖毛運動性測定評估粘液纖毛清除功能；使用MicrobiomeAnalyst、BacDive等生物信息學工具進行微生物組數據分析；并通過氣管內微生物移植實驗探討微生物與宿主的因果關系。
ESTABLISHMENT OF THE VITAMIN A-DEFICIENT MOUSE MODEL
研究人員首先建立了維生素A缺乏小鼠模型。將8周大的野生型C57BL/6J小鼠維持VAS或VAD飲食8周。通過分析維生素A代謝相關基因表達，發現VAD肺部Lrat表達降低（表明視黃醇向可逆儲存形式視黃酯的轉化減少），而Aldh1a1表達增加（表明從視黃醇向視黃酸(RA)的轉化率增加）。差異表達基因分析準確地將VAS和VAD樣本聚類，且ChIP-X富集分析(ChEA)顯示，視黃酸/視黃醇受體靶基因在VAD樣本中高度富集。這些發現證實，從小鼠飲食中去除維生素A8周后，可在小鼠肺部實現維生素A缺乏。
VAD LEADS TO EPITHELIAL REMODELING IN ADULT MOUSE LUNGS
經過8周的膳食維生素A缺乏后，研究人員通過染色整個肺部樣本分析下呼吸道(LRT)近端和遠端氣道形態變化。結果顯示，與VAS對照組相比，VAD小鼠肺部氣道發生上皮重塑，特征包括上皮剝脫和細胞碎片、平滑肌層增厚、局灶性增生，以及表達增殖標志物Ki-67的上皮細胞數量增加。轉錄因子富集分析顯示，VAD數據集中富集了肺上皮、外胚層上皮干細胞和髓系細胞的基因特征，以及促增殖轉錄因子FOXM1、JUN和E2F4。定量分析顯示VAD氣道中局灶性增生上皮區域顯著增加，Ki67陽性細胞計數和Mki67 RNA表達均支持VAD氣道上皮增殖增加。
MUCOCILIARY CLEARANCE IS IMPAIRED IN VAD LUNGS
研究人員進一步探討了VAD誘導的氣道上皮重塑中涉及的細胞類型。他們檢測了LRT中主要上皮細胞類型的RNA表達，發現VAD肺部兩種分泌細胞標志物(Scgb1a1和Scgb3a2)基因表達顯著增加，而纖毛細胞標志物(Foxj1和Tubb4a)變化不大。氣道上皮細胞定量計數顯示，VAD肺部分泌細胞相對于纖毛細胞的比例增加。免疫組織化學顯示，VAD氣道增生區域分泌細胞標志物CC10和纖毛標志物TUBB4A的頂端蛋白表達顯著降低�；蚣患治鲲@示，VAD數據集中與纖毛組裝和運輸相關的通路顯著富集。通過體外纖毛運動性測定發現，VAD氣管中熒光微球的速度和移動距離顯著降低，證實VAD導致肺內氣道上皮重塑特征性纖毛功能障礙，引起粘液纖毛清除功能崩潰。
GENE EXPRESSION ANALYSIS OF THE LUNG MICROBIOME INDICATES DYSBIOSIS AND PREDISPOSITION TO DISEASE IN VAD LUNGS
纖毛功能障礙導致MCC受損，這是維持適當肺部穩態的最重要機制之一。為了研究慢性VAD是否會使成年小鼠肺部易于呼吸道感染，研究人員從整個肺勻漿中提取微生物RNA，分別在膳食調制3周和8后進行分析。α多樣性分析顯示VAD樣本的α多樣性增加（p=0.072），β多樣性顯示VAS和VAD組分別聚類（p=0.01）。盡管qRT-PCR未顯示細菌負荷顯著變化，但DESeq2分析顯示細菌和真菌的相對豐度發生顯著變化（p=0.025和0.020）。具體而言，Planctomycetes等病原菌在8周時最為豐富，而有益真菌子囊菌門(Ascomycota)的相對豐度早在第3周就急劇下降。功能分析顯示，8周時VAD肺部抗生素耐藥菌相對豐度降低，需氧菌過度豐富，革蘭氏陰性菌相對于革蘭氏陽性菌增加。
VAD ENCOURAGES BACTERIAL COLONIZATION IN THE LOWER RESPIRATORY TRACT
為了確定VAD誘導的肺部菌群失調如何影響LRT內細菌的定位和定植，研究人員使用MicrobiomeAnalyst分析了8周RNA-seq樣本。數據顯示，假單胞菌門(Pseudomonadota)和奇異球菌門(Deinococcota)主要存在于VAD肺部，而共生菌厚壁菌門(Bacillota)主要在VAS肺部表達。物種水平分析發現6種微生物達到顯著性閾值，其中子囊菌門的Saprocaete是真菌中唯一顯著改變的。細菌革蘭氏染色觀察到VAD氣道上皮存在含有革蘭氏陽性菌的3維結構（生物膜）以及大量浮游革蘭氏陰性菌。微生物移植實驗顯示，VAS肺部暴露于VAD微生物移植3周后出現革蘭氏陽性菌侵襲和定植的早期跡象。
研究結論表明，膳食維生素A缺乏(VAD)導致下呼吸道上皮重塑，特征為上皮剝脫、局灶性增生、平滑肌增厚和纖毛功能喪失。局灶性增生導致分泌細胞富集和氣道頂端分泌及纖毛蛋白表達喪失，引起MCC崩潰。這些變化為肺部菌群失調創造了許可環境，其中低豐度和潛在致病微生物富集，革蘭氏陽性菌發生從浮游到固著粘附的功能轉變，導致生物膜形成。
討論部分強調，這是首個描述維生素A代謝物、肺部和肺部微生物組之間功能相互作用的研究。數據表明VAD通過結構和轉錄組機制損害上皮屏障完整性。除了氣道上皮的結構改變外，數據還表明VAD可能損害先天免疫反應，進一步促進微生物定植。微生物菌群失調導致肺部炎癥、感染和疾病增加。該研究的一個有前景的未來方向是觀察到真菌對宿主維生素A狀態的敏感性，突出了真菌類群作為營養不良患者氣道重塑和感染風險敏感生物標志物的潛力。這些觀察結果開辟了有前景的轉化途徑，特別是在開發微生物組信息診斷和靶向營養干預措施方面。
該研究有幾個局限性需要考慮。雖然小鼠模型提供了精確的飲食控制和遺傳一致性，但不能完全反映人類肺生理的復雜性或營養不良的多因素性質。此外，使用全肺勻漿可能無法準確反映成年肺的空間微生物異質性。未來研究將需要驗證這些發現的臨床相關性，并確定跨物種保守的微生物或上皮特征。
總之，這項工作提供了令人信服的證據，表明維生素A在維持肺部上皮完整性和微生物穩態中起著至關重要的作用。研究結果強調了維生素A狀態不僅影響宿主上皮完整性，還影響微生物定植動態，為理解營養-宿主-微生物在呼吸健康中的復雜相互作用提供了新的見解，對公共衛生和臨床實踐具有重要意義。
