《Scientific Reports》：Kazal-type serine protease inhibitors from Arabidopsis thaliana and Toxoplasma gondii exhibit antimicrobial activity against plant pathogens
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本研究針對植物病害防治中新型生物農藥的迫切需求，聚焦于Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑(KPIs)的抗菌功能。研究人員系統評估了擬南芥來源的rAtKPI-1T和弓形蟲來源的rTgPI-1及其截短體(rTgPI-1NT/rTgPI-1CT)對丁香假單胞菌和灰葡萄孢的抗病原活性。結果表明這些重組KPIs能濃度依賴性地抑制細菌生長(rTgPI-1對P. viridiflava的MIC50低至1μM)，并通過表面結合和蛋白酶抑制雙重機制發揮作用。該研究揭示了KPIs結構域功能分化的新規律，為開發靶向病原菌關鍵蛋白酶的新型生物制劑提供了理論依據。
在農業生產中，病原微生物導致的作物病害每年造成巨大的經濟損失。其中，由丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）引起的細菌性病害和由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引發的灰霉病尤為突出，傳統化學農藥的過度使用不僅導致病原菌抗藥性增強，還帶來環境污染和食品安全問題。因此，開發新型、高效、環境友好的生物防治策略成為當務之急。
植物在長期進化過程中形成了一套復雜的防御系統，絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serine Protease Inhibitors, SPIs）是其中重要的組成部分。它們能夠抑制病原微生物分泌的絲氨酸蛋白酶，這些蛋白酶是病原菌破壞植物組織、獲取營養的關鍵毒力因子。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑（Kazal-type Serine Protease Inhibitors, KPIs）是SPIs家族中特征較為明確的一類，在動物和微生物中研究較多，但其在植物防御系統中的具體功能，特別是針對植物病原菌的抑制作用機制，尚不清晰。
在此背景下，由Manuel A. Sanchez、Karen N. Strack、Luisa F. Mendoza-Morales等作者組成的研究團隊，在《Scientific Reports》上發表了他們的最新研究成果。該研究深入探究了來源于模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的AtKPI-1和來源于專性細胞內寄生原蟲弓形蟲（Toxoplasma gondii）的TgPI-1這兩種KPIs的抗植物病原菌活性。研究人員不僅評估了全長蛋白（rAtKPI-1T和rTgPI-1）的效果，還創新性地構建并分析了TgPI-1的兩個截短變體——包含N端第1、2結構域的rTgPI-1NT和包含C端第3、4結構域的rTgPI-1CT，旨在揭示不同Kazal結構域在抗菌功能中的特異性貢獻。
為了開展這項研究，作者團隊運用了多項關鍵技術。他們通過原核表達系統（大腸桿菌BL21(DE3)和M15）制備了重組KPIs，并利用鎳柱親和層析進行純化。抗菌活性通過細菌生長抑制實驗和最小抑制濃度（MIC50）測定進行評估。分子相互作用機制則通過細菌結合實驗和間接免疫熒光（IIF）技術進行探究。此外，針對灰葡萄孢的防治潛力，通過分生孢子萌發抑制實驗進行驗證。
表達和純化重組KSPIs
研究人員成功表達了帶有His標簽的重組蛋白rAtKPI-1T、rTgPI-1及其兩個截短版本rTgPI-1NT和rTgPI-1CT。rTgPI-1NT包含具有胰蛋白酶抑制特異性的結構域，而rTgPI-1CT則包含具有彈性蛋白酶抑制特異性的結構域。通過鎳親和層析，從大腸桿菌裂解液中純化出了可溶性的重組蛋白，為后續功能研究奠定了基礎。
rAtKPI-1T、rTgPI-1、rTgPI-1NT和rTgPI-1CT的細菌生長抑制活性
研究結果顯示，四種重組KPIs在7μM濃度下均能有效抑制三種植物病原細菌（P. syringae DC3000、P. syringae (AvRpm1)和P. viridiflava）的生長。在3.5μM濃度下，不同KPIs的抑制效果出現差異。進一步的MIC50（半數抑制濃度）測定表明，rTgPI-1及其截短體（尤其是rTgPI-1CT）的抗菌活性普遍強于rAtKPI-1T。例如，rTgPI-1和rTgPI-1CT對P. viridiflava的MIC50低至1μM，而rAtKPI-1T為10μM。此外，研究人員還探索了rTgPI-1NT和rTgPI-1CT的協同作用，發現在抑制P. viridiflava時，兩者混合使用可達到與全長rTgPI-1相似的效果，提示了結構域間的 additive effect（相加效應）。
rAtKPI-1T、rTgPI-1、rTgPI-1NT和rTgPI-1CT的細菌結合活性
為了探究抗菌作用的機制，研究人員進行了細菌結合實驗。結果表明，rAtKPI-1T、rTgPI-1和rTgPI-1NT能夠與測試的細菌結合，但結合強度與特性不同。rAtKPI-1T與細菌的結合非常牢固，即使在SDS處理后仍存在于沉淀中。rTgPI-1和rTgPI-1NT則表現為較弱或可逆的結合。而rTgPI-1CT的結合最弱，僅在SDS處理前的步驟中能被檢測到。間接免疫熒光實驗直觀地證實了這些結合差異，并顯示不同KPIs在細菌表面的定位存在菌株特異性，例如rTgPI-1能與所有三種測試細菌結合，而rTgPI-1CT主要結合P. syringae (AvRpm1)和P. viridiflava。
rTgPI-1NT和rTgPI-1CT對灰葡萄孢分生孢子萌發的體外抑制
除了抗菌活性，研究還評估了截短蛋白的抗真菌效果。rTgPI-1NT和rTgPI-1CT均能顯著抑制灰葡萄孢分生孢子的萌發和芽管伸長，且抑制作用呈濃度和時間依賴性。值得注意的是，在286 nM濃度下，rTgPI-1CT的抑制效果顯著強于rTgPI-1NT，表明C端結構域在抗真菌活性中扮演了更關鍵的角色。
綜上所述，本研究系統地證實了來源于擬南芥和弓形蟲的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑具有廣譜的抗植物病原菌活性。其作用機制涉及對病原菌的直接結合以及對其關鍵絲氨酸蛋白酶的抑制。研究的一個重要發現是，多功能KPIs的不同結構域（如rTgPI-1的N端和C端）可能具有獨特且互補的生物學功能：rTgPI-1NT（P1位點為精氨酸，傾向于抑制胰蛋白酶樣蛋白酶）在抑制某些細菌方面表現較好，而rTgPI-1CT（P1位點為亮氨酸，傾向于抑制彈性蛋白酶樣蛋白酶）則表現出更強的抗真菌活性。這種結構域功能的特化，為未來設計具有特定靶向性的工程化蛋白酶抑制劑用于作物保護提供了寶貴的見解和全新的思路。該研究不僅深化了對植物先天免疫中蛋白酶抑制劑功能的理解，也展示了利用非植物來源（如寄生蟲）的活性蛋白進行植物保護的巨大生物技術潛力，為開發新一代綠色農藥開辟了新的途徑。
