《Scientific Reports》：Evaluation of quantitative polymerase chain reaction for detecting BRCA1 or BRCA2 copy number loss in high-grade serous ovarian cancer
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本研究針對高級別漿液性卵巢癌(HGSOC)中BRCA1/2拷貝數(shù)缺失(CNL)檢測方法進行系統(tǒng)評估。研究人員通過兩個臨床隊列(n=441)和細胞系面板，比較qPCR與測序方法(panel測序和全基因組測序WGS)的檢測效能。結(jié)果顯示qPCR靈敏度極低(BRCA1 0-11.5%，BRCA2 10-36.8%)，主要由于參考基因座RPPH1的拷貝數(shù)變異(CNV)干擾。該研究警示在基因組不穩(wěn)定癌癥中使用qPCR檢測CNL的局限性，為臨床基因檢測方法選擇提供重要依據(jù)。
在卵巢癌的治療領(lǐng)域，PARP抑制劑的出現(xiàn)為攜帶BRCA1/2基因異常的患者帶來了新的希望。然而，除了常見的基因突變外，BRCA1/2基因的拷貝數(shù)缺失(CNL)同樣會導致同源重組缺陷(HRD)，從而影響PARP抑制劑的療效。目前臨床上面臨著一個重要挑戰(zhàn)：如何準確、經(jīng)濟地檢測這些拷貝數(shù)缺失事件。
傳統(tǒng)的全基因組測序(WGS)雖然準確，但成本高、耗時長，在臨床推廣中存在諸多限制。相比之下，定量PCR(qPCR)作為一種快速、經(jīng)濟的檢測方法，理論上非常適合臨床常規(guī)檢測。但是，在基因組高度不穩(wěn)定的高級別漿液性卵巢癌(HGSOC)中，qPCR是否能準確檢測BRCA1/2拷貝數(shù)缺失，此前尚未有系統(tǒng)評估。
為此，愛丁堡大學的研究團隊在《Scientific Reports》上發(fā)表了這項重要研究，對qPCR檢測BRCA1/2拷貝數(shù)缺失的可靠性進行了全面評估。研究人員設(shè)計了一項嚴謹?shù)亩嚓犃序炞C研究，涵蓋了兩個獨立的HGSOC患者隊列(共441例)和一個HGSOC細胞系面板。
關(guān)鍵技術(shù)方法包括：使用TaqMan基因分型qPCR拷貝數(shù)檢測試劑盒分析BRCA1/2拷貝數(shù)，以panel測序(隊列1)和全基因組測序(隊列2和細胞系)為金標準；采用CopywriteR和CNVkit進行拷貝數(shù)分析；整合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)評估基因表達；通過腫瘤細胞含量分析和參考基因座拷貝數(shù)驗證探討檢測偏差來源。
分布qPCR檢測的BRCA1/2拷貝數(shù)缺失(隊列1)
在355例HGSOC患者隊列中，qPCR檢測顯示BRCA1和BRCA2拷貝數(shù)缺失的發(fā)生率分別為6.4%和16.9%。值得注意的是，絕大多數(shù)(91%)BRCA1缺失樣本同時伴有BRCA2缺失，這種共缺失模式引起了研究人員的關(guān)注。
與測序數(shù)據(jù)的全基因組拷貝數(shù)評估比較(隊列1)
以CopywriteR測序方法為基準，qPCR檢測BRCA1和BRCA2拷貝數(shù)缺失的靈敏度分別僅為11.5%和36.8%。兩種方法檢測到的拷貝數(shù)缺失分布存在顯著差異，特別是BRCA1/2共缺失的發(fā)生率在qPCR檢測中明顯偏高(5.6% vs 1.1%)。
BRCA1/2 mRNA表達在BRCA1/2拷貝數(shù)缺失病例中(隊列1)
在BRCA1/2野生型腫瘤中，qPCR檢測到的BRCA1拷貝數(shù)缺失與BRCA1 mRNA表達水平無顯著相關(guān)性。BRCA2拷貝數(shù)缺失腫瘤雖然表現(xiàn)出較低的BRCA2 mRNA表達趨勢，但未達到統(tǒng)計學顯著性。
影響qPCR檢測拷貝數(shù)缺失的實驗因素(隊列1)
研究人員發(fā)現(xiàn)，參考基因RPPH1(編碼RNaseP)的拷貝數(shù)存在顯著變異(中位拷貝數(shù)2.59±1.96)，且在qPCR檢測顯示BRCA1/2共缺失的樣本中，RPPH1拷貝數(shù)顯著更高(5.20±4.81 vs 2.48±1.34)。這一發(fā)現(xiàn)為解釋qPCR檢測偏差提供了關(guān)鍵線索。
qPCR在獨立全基因組測序隊列中的表現(xiàn)(隊列2)
在86例具有匹配腫瘤-正常全基因組測序的獨立隊列中，qPCR檢測BRCA1/2拷貝數(shù)缺失的靈敏度進一步降低至0-10%。這一結(jié)果在高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)支持下，進一步證實了qPCR在檢測拷貝數(shù)缺失方面的局限性。
qPCR在HGSOC細胞系中的表現(xiàn)
細胞系實驗進一步驗證了參考基因座拷貝數(shù)變異對qPCR準確性的影響。當使用RPPH1作為參考基因時，50%的細胞系顯示BRCA1拷貝數(shù)與WGS結(jié)果存在超過30%的差異。即使引入第二個參考基因TERT，也未能顯著改善檢測準確性，因為TERT位點本身在癌癥中也存在拷貝數(shù)變異。
研究結(jié)論強調(diào)，在基因組高度不穩(wěn)定的HGSOC中，qPCR使用標準試劑盒無法可靠檢測BRCA1/2拷貝數(shù)缺失。參考基因座的拷貝數(shù)變異是導致假陽性結(jié)果的主要干擾因素。這一發(fā)現(xiàn)對臨床檢測實踐具有重要啟示：在考慮使用qPCR進行拷貝數(shù)缺失檢測時，必須謹慎評估目標癌癥類型的基因組穩(wěn)定性特征。
該研究的深遠意義在于，它不僅揭示了qPCR在檢測腫瘤抑制基因拷貝數(shù)缺失方面的局限性，更為精準醫(yī)學時代的基因檢測方法選擇提供了重要參考。對于HGSOC這類以基因組不穩(wěn)定為特征的癌癥，基于測序的結(jié)構(gòu)變異檢測方法仍然是識別BRCA1/2拷貝數(shù)缺失的金標準。這一結(jié)論可能同樣適用于其他基因組不穩(wěn)定的癌癥類型，為未來癌癥基因檢測策略的優(yōu)化指明了方向。
