《Scientific Reports》：Computational characterization of GRP78 binding sites on mitochondrial GPX4: implications for targeting ferroptosis in triple-negative breast cancer
編輯推薦：
本研究針對三陰性乳腺癌(TNBC)治療選擇有限的難題，通過計算生物學方法系統揭示了分子伴侶GRP78與線粒體谷胱甘肽過氧化物酶4(mGPX4)的相互作用機制。研究人員采用蛋白質-蛋白質對接、分子動力學模擬和MM/GBSA結合自由能計算等技術，發現GRP78的SBDβ結構域與mGPX4多個區域形成穩定復合物，其中區域II結合親和力最高(△G=-86.39 kcal/mol)。這一發現為通過破壞GRP78-mGPX4相互作用來增強TNBC細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性提供了新靶點。
在乳腺癌的諸多亞型中，三陰性乳腺癌(TNBC)以其侵襲性強、易轉移和治療選擇有限而備受關注。約占所有乳腺癌病例20%的TNBC，由于缺乏雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER2)的表達，使得常規的靶向治療難以奏效。盡管化療仍是主要治療手段，但TNBC患者往往面臨更高的遠處復發風險和更差的總體生存率。在這一背景下，探索新的治療策略成為當務之急。
近年來，鐵死亡(ferroptosis)作為一種新發現的調節性細胞死亡形式，在癌癥治療領域展現出巨大潛力。這種鐵依賴性的細胞死亡由脂質氫過氧化物積累觸發，而其關鍵調控因子谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的功能障礙則是導致鐵死亡的核心機制。有趣的是，癌細胞特別是TNBC細胞，能夠通過某種機制逃避鐵死亡誘導劑的殺傷，從而在氧化應激環境下存活。
那么，TNBC細胞是如何獲得這種抵抗能力的呢？研究人員將目光投向了葡萄糖調節蛋白78(GRP78)。作為內質網應激反應的關鍵分子伴侶，GRP78在多種癌癥中過度表達，支持腫瘤生存、增殖、化療耐藥、血管生成和轉移。盡管GRP78以其在內質網中結合錯誤折疊蛋白質而聞名，但它在腫瘤細胞表面的出現以及其與GPX4的潛在相互作用，可能為解釋TNBC細胞的鐵死亡抵抗提供了線索。
為了深入探究這一問題，發表在《Scientific Reports》上的這項研究采用了一系列先進的計算生物學方法。研究人員主要通過以下關鍵技術展開研究：利用AlphaFold2預測線粒體GPX4(mGPX4)的三維結構并進行模型優化驗證；運用HADDOCK 2.4進行GRP78與mGPX4的蛋白質-蛋白質對接分析；通過GROMACS進行100納秒的分子動力學模擬，評估復合物穩定性；采用MM/GBSA方法計算結合自由能并進行能量分解。
3.1. Pep42與GPX4功能區域的比較三維結構分析
研究人員首先利用AlphaFold2生成了mGPX4的三維結構模型，該模型平均pLDDT值為89.4，表明整體拓撲結構的高置信度。特別值得注意的是，mGPX4的N端線粒體靶向片段(殘基1-27)得分低于50，反映了其在導入前的固有無序特性，而包含區域7的催化核心則表現出高pLDDT值(>85)和明確定義的二級和三級結構。序列比對顯示，GPX4區域R1、R2、R3和R7與Pep42的同一性分別為30%、30.77%、38.46%和42.86%，且多個保守殘基被觀察到。重要的是，所有GPX4區域均表現出與Pep42相似的疏水性特征(GRAVY指數約為1.2-1.5)，且約80-93%的殘基為非極性殘基，這種物理化學性質的相似性為它們與GRP78的類似結合行為提供了基礎。
3.2. 全長mGPX4包膜與GRP78的結合
對接實驗揭示了GRP78與mGPX4的最佳結合模式。PRODIGY預測的結合親和力從-7.7±0.5到-10.5±0.6 kcal/mol，均超過環肽Pep42的親和力(-6.9±0.1 kcal/mol)。位于線粒體導入區域的區域III表現出最高的結合親和力(△G=-10.5±0.6 kcal/mol)。基于HADDOCK結果，區域II被確定為最優結合位點，得分為-72.0±5.4，顯著優于其他區域。從結構角度看，區域II采用穩定的螺旋-環構象，富含溶劑暴露的疏水和極性側鏈，這種排列完美地嵌入GRP78的疏水溝槽，同時形成穩定的氫鍵網絡。
相互作用的分子機制分析表明，GRP78主要通過氫鍵和疏水相互作用與mGPX4結合。在區域II復合物中，GRP78 SBDβ形成了8個氫鍵和3個疏水相互作用，創建了連續的極性接觸鏈，使mGPX4中央片段沿GRP78的β-片層邊緣對齊。這些廣泛的極性-疏水相互作用可能構成了mGPX4識別的核心穩定界面。
3.3. GRP78與mGPX4結合的構象動力學和能量表征
分子動力學模擬分析了GRP78結合對mGPX4構象穩定性的影響。RMSD分析顯示，未結合的mGPX4波動較大(平均16.31 ?)，而GRP78則表現出顯著穩定性(平均5.27 ?)。與GRP78形成復合物后，區域VII和區域II復合物使mGPX4的RMSD最大程度降低(分別為9.83 ?和13.34 ?)，反映了結合后結構穩定性的提高。
RMSF分析進一步表明，GRP78在區域VII的結合產生了所有復合物中最低的RMSF(3.82 ?)，表明局部殘基運動受到明顯限制。相比之下，在區域I、II和III的結合增加了mGPX4的RMSF(7.25-7.99 ?)，表明局部流動性增加�；剞D半徑(Rg)分析顯示，與線粒體靶向區域I、II和III對應的復合物表現出最高的Rg值(39.36-41.31 ?)，表明GRP78在這些位點的結合松弛了蛋白質結構，可能揭示或改變了線粒體導入信號。
溶劑可及表面積(SASA)分析表明，mGPX4-R1/GRP78復合物顯示出最大的平均SASA(64851.29 ?2)，表明結合誘導了更開放、靈活的構象。氫鍵分析顯示，GRP78在區域II、III和VII與mGPX4結合時，平均氫鍵數量顯著增加至198-200個，表明通過密集、穩定的氫鍵網絡顯著增強了結構完整性。
3.3.1. 結合自由能結果和能量貢獻
MM-GBSA分析顯示，復合物2(mGPX4-R2/GRP78)具有最有利的總結合自由能(-86.39 kcal/mol)，主要來自強靜電相互作用(△Eel=-321.56 kcal/mol)和顯著的范德華力(△VdWaals=-74.25 kcal/mol)。復合物4的結合自由能較低(-45.20 kcal/mol)，但具有更緊湊和結構穩定的界面，具有平衡的范德華力和靜電貢獻。每個殘基的結合能量貢獻分析確定了GRP78中ARG1488、VAL1490和VAL1453等關鍵殘基，這些殘基在不同mGPX4-GRP78 SBDβ復合物中穩定結合中起關鍵作用。
研究結論表明，GRP78通過其底物結合域β(SBDβ)與mGPX4的特異性相互作用，可能在TNBC細胞抵抗鐵死亡中發揮關鍵作用。在分析的區域中，區域II提供最高的結合能量，而區域VII形成最緊湊、潛在最穩定的復合物，使得這兩個位點對于GRP78-mGPX4相互作用都至關重要。這些發現為設計破壞該復合物的抑制劑奠定了基礎，旨在抑制腫瘤生長、克服耐藥性并削弱癌細胞存活。
這項研究的重要意義在于揭示了一個新的治療策略：通過破壞GRP78-GPX4相互作用來 destabilize GPX4，削弱其保護功能，從而使TNBC細胞對鐵死亡誘導劑敏感。由于TNBC缺乏特異性靶向治療且經常對標準治療產生耐藥性，這種方法可能作為有價值的補充或輔助選擇。能夠阻斷GRP78穩定GPX4的小分子、肽或抗體，有潛力增強鐵死亡基礎治療的療效，繞過耐藥機制，最終改善TNBC的臨床結局。
