《Scientific Reports》：The A2357T substitution in the kinase domain of yeast Tor1 confers growth promoting TORC1 activity independent of Gtr1/2 and Pib2
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本研究針對酵母TORC1上游調控機制的核心問題，通過遺傳學方法證實Gtr1/2和Pib2是維持TORC1活性的關鍵調控因子。研究人員發現Tor1激酶結構域A2357T顯性突變能夠獨立激活TORC1，為理解TORC1自主調控機制及人類mTOR相關癌癥突變功能提供了新視角。
在真核細胞中，雷帕霉素靶蛋白復合物1（TORC1）如同細胞的指揮中心，時刻整合營養、能量等多種信號來調控細胞生長。當營養充足時，TORC1活躍，促進蛋白質合成等建設性過程；當營養匱乏時，其活性降低，細胞啟動自噬等分解代謝過程以應對危機。在酵母細胞中，TORC1的活性主要受兩個上游調控因子控制：Gtr1/2 GTP酶復合物（類似于哺乳動物的Rag GTP酶）和Pib2蛋白（一種氨基酸傳感器）。長期以來，科學界普遍認為Gtr1/2和Pib2是TORC1最主要的，甚至是唯一的直接正調控因子，因為同時缺失這兩個因子的酵母細胞是無法存活的。然而，這種“合成致死”現象背后是否真的不存在其他激活TORC1的途徑？在某些特定條件下，TORC1是否能夠不依賴這兩者而保持一定活性？這些問題一直吸引著科學家們的探索。
為了深入探究這一基礎生物學問題，來自布魯塞爾自由大學的研究團隊在《Scientific Reports》上發表了一項創新性研究。他們不僅系統驗證了Gtr1/2和Pib2在TORC1激活中的核心地位，更令人興奮的是，發現了一個位于Tor1激酶結構域的關鍵突變（A2357T），該突變能夠“繞開”上游調控，賦予TORC1一定的自主活性，從而在缺乏Gtr1/2和Pib2的條件下支持細胞生長。這一發現為理解TORC1的調控機制開辟了新視角，并對研究與人類癌癥相關的mTOR突變具有重要啟示。
研究人員在研究中運用了幾個關鍵的技術方法：他們利用酵母遺傳學手段構建了條件性表達PIB2基因的菌株（GAL-PIB2），從而能夠在實驗控制下完全關閉Gtr1/2和Pib2的功能。通過在全基因組水平進行測序，他們精準定位了導致抑制表型的突變位點。此外，研究還結合了免疫印跡技術，通過檢測Sch9 kinase在Thr737位點的磷酸化水平以及Npr1 kinase的磷酸化狀態，作為評估TORC1體內活性的可靠指標。
Roles of Gtr1/2 and Pib2 in early and late activation of yeast TORC1 upon NH+4addition
研究首先深入分析了Gtr1/2和Pib2在銨離子（NH+4）刺激下對TORC1早期和晚期激活的貢獻。研究人員發現，在缺乏Gtr1/2的細胞中，NH+4誘導的TORC1早期激活受損，但其晚期的、更持續的激活則基本不受影響。相反，在pib2Δ突變株中，TORC1的早期和晚期激活均受到不同程度的影響。這些結果表明，Gtr1/2和Pib2在TORC1激活的不同階段扮演著協同而又有所側重的角色，其協作程度可能因激活時相而異。
Phenotypes of a gtr1△ gtr2△ GAL-PIB2 strain
為了嚴格驗證是否真的不存在其他能支持細胞生長的TORC1激活因子，研究人員構建了一個gtr1Δ gtr2Δ GAL-PIB2菌株。該菌株在半乳糖培養基中（可誘導PIB2表達）生長正常，但在葡萄糖培養基中（抑制PIB2表達）則無法生長。這一結果在含有25種不同氮源的培養基上均得到證實，強有力地支持了Gtr1/2和Pib2是維持酵母細胞生長所必需的、主要的TORC1上游激活因子。
Characterization of a TOR1 mutation enabling a strain to grow without expressing Gtr1/2 and Pib2
有趣的是，在無法生長的gtr1Δ gtr2Δ GAL-PIB2菌株平板上，經過長時間培養后，出現了罕見的能夠生長的抑制子菌落。遺傳分析表明，這種不依賴Gtr1/2和Pib2的生長能力是由一個顯性突變所賦予。全基因組測序揭示，該突變是TOR1基因上的一個點突變，導致Tor1蛋白第2357位的丙氨酸（Alanine, A）被蘇氨酸（Threonine, T）取代（A2357T）。將含有此突變的TOR1基因導入親本菌株，足以重現不依賴Gtr1/2和Pib2的生長表型。然而，這種生長是亞優的，并且對雷帕霉素高度敏感。進一步的生化分析顯示，Tor1A2357T突變體僅能恢復部分TORC1活性（約為野生型的30%），但這已足以維持基本的細胞增殖。
The Tor1A2357T substitution lies in a highly conserved sequence of the Tor1 kinase domain
對突變位點的分析顯示，A2357位于Tor1激酶結構域的C葉一個高度保守的kα9螺旋結構中。值得注意的是，該位點相鄰的是一個谷氨酸（Glutamate, E）殘基，而在人類mTOR中，對應于此E-A氨基酸對的突變（如E2419K, A2420V）已在多種癌癥組織中被發現。有研究表明，該區域鄰近一個被稱為負調控結構域的區域，該區域可能通過空間位阻效應抑制激酶活性。因此，A2357T突變可能通過變構效應緩解了這種自抑制，從而在一定程度上模擬了Gtr1/2或Pib2結合所可能引起的激活構象變化。
綜上所述，本研究通過嚴謹的遺傳學實驗證實，在常規生長條件下，Gtr1/2和Pib2確實是酵母TORC1不可或缺的上游激活因子。然而，研究最重要的發現在于鑒定出一個位于TOR1激酶結構域的顯性點突變（A2357T），該突變能夠賦予TORC1一定的、不依賴于經典上游激活通路的自主活性。盡管這種活性較弱，但它足以繞過Gtr1/2和Pib2缺失所造成的致命缺陷，維持細胞的基本生長。這一發現具有多重重要意義：首先，它在分子水平上揭示了一個潛在的TORC1自抑制調控模塊，為理解其激酶活性的內在調控機制提供了新思路。其次，該突變位點在人類mTOR中的對應位置是著名的癌癥突變熱點，這表明酵母中發現的這一調控機制在進化上可能是保守的。因此，本研究不僅深化了對基礎細胞生長調控通路的理解，也為探討人類疾病中mTOR異常激活的機制提供了一個有價值的模型。未來研究將聚焦于解析A2357T突變影響TORC1空間結構和活性的精確分子機制，并探索其在人類mTOR相關疾病中的潛在應用價值。
