《Communications Medicine》：High-throughput spheroid-based assay for functional breast cancer precision medicine facilitated by deep learning
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本研究針對乳腺癌精準醫療中治療反應預測的難題，開發了一種基于深度學習的高通量腫瘤球體功能檢測方法。研究人員利用患者來源異種移植模型，通過自動化的球體分割技術評估了奧拉帕尼、順鉑和放療的療效差異。結果顯示該檢測能準確區分同源重組修復功能正常/缺陷腫瘤的藥物敏感性，為臨床個性化治療方案選擇提供了新型功能學評估平臺。
在乳腺癌治療領域，尤其是三陰性乳腺癌，盡管治療手段不斷進步，但仍是全球女性癌癥相關死亡的主要原因。約20%的患者會發展成轉移性疾病，治療更加困難。某些腫瘤因存在同源重組修復缺陷，為聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑等靶向治療提供了機會，但治療效果存在個體差異。因此，需要功能性檢測方法來預測最佳個性化治療方案。
目前臨床可用的基于測序的同源重組缺陷狀態檢測方法存在局限性，而功能性檢測可以彌補基因組學精準腫瘤學的不足。雖然RECAP檢測能通過照射后腫瘤標本中RAD51焦點數量來確定同源重組缺陷狀態，但它只能確定同源重組缺陷狀態，不能直接提供預期治療反應的信息。報告治療反應的功能性檢測需要個性化的腫瘤模型作為患者替身。
體內腫瘤具有復雜的細胞間通訊和信號通路，這是其三維結構和異質性所致，而單層細胞培養缺乏這些特征，因此可能對DNA損傷劑產生不同的反應。因此，三維細胞模型能更好地模擬體內條件，可作為患者替身。其中，腫瘤球體是由腫瘤細胞形成的球形聚集體，適合用于高通量藥物篩選。
為了全面評估腫瘤的異質性，高通量檢測有助于評估平均腫瘤反應和反應異質性。腫瘤體積評估是最常用的確定治療反應的參數之一，因此球體大小已被用于評估此反應。為了確定球體大小的變化，可以使用各種圖像分析方法來自動化球體分割和大小測量。
在這項發表于《Communications Medicine》的研究中，Ben Haspels、Maarten W. Paul等研究人員開發了一種高通量球體檢測方法，結合深度學習自動球體分割，用于功能性乳腺癌精準醫療。他們使用對順鉑敏感和耐藥的乳腺癌患者來源異種移植模型，測試了球體對順鉑、奧拉帕尼和放療的反應，并建立了一種基于預測應答和非應答球體百分比來區分敏感和耐藥腫瘤的方法。
研究采用的關鍵技術方法包括：利用患者來源異種移植乳腺癌小鼠模型建立腫瘤球體；通過Segment Anything Model框架進行深度學習驅動的自動球體分割和大小測定；使用RECAP檢測驗證模型的同源重組修復狀態；通過免疫熒光染色分析細胞凋亡、增殖和DNA損傷反應。
治療反應性PDX球體忠實地反映預期的體內反應
研究人員使用了同源重組缺陷的三陰性乳腺癌患者來源異種移植模型，該模型因BRCA1突變而對順鉑敏感，并通過反復體內順鉑治療建立了順鉑耐藥模型。通過RECAP檢測確認了敏感模型的同源重組缺陷狀態和耐藥模型的同源重組修復正常狀態。
使用瓊脂糖模具系統從敏感和耐藥腫瘤中產生球體，每個條件可產生256個球體。形成的球體形態一致，直徑為150-300微米，主要由腫瘤細胞組成，且整個球體中均含有增殖細胞，表明球體不包含壞死核心。
研究測試了這些球體對順鉑、PARP抑制劑奧拉帕尼和照射的反應。結果顯示，敏感球體經順鉑、奧拉帕尼和輻射處理后，通過切割 caspase-3染色強度顯著增加表明細胞凋亡被誘導，且凋亡存在于整個球體中。奧拉帕尼或放療處理后細胞增殖顯著減少，但順鉑處理后敏感球體中仍有較多的EdU陽性細胞。耐藥球體對順鉑和奧拉帕尼沒有反應，未觀察到細胞凋亡，且奧拉帕尼處理的耐藥球體與對照組相比，EdU陽性細胞數量無顯著差異。敏感和耐藥球體對輻射的反應相似。
總體而言，敏感和耐藥球體忠實地顯示了各自治療預期的體內反應。然而，研究人員注意到，同一生物樣本中，治療誘導的細胞凋亡程度和細胞增殖抑制程度在不同球體間存在顯著差異，表明需要一種能夠捕捉球體異質性的替代檢測方法。
使用AI模型自動球體分割和大小測定
球體大小受細胞死亡和增殖的影響，因此可能是治療反應的合適讀數。監測球體大小的另一個優點是，與染色相比需要更少的樣品制備，并允許在不同時間點對相同球體進行縱向測量。
高通量分析球體大小需要自動分割。研究人員探索了多種選項，最終采用了專為光學和電子顯微鏡設計的Segment Anything Model的Python實現版本，該版本允許使用額外的圖像編碼器進行自動實例分割的模型微調。未對數據進行微調的模型無法準確分割球體，但在圖像上進行微調后，球體分割效果大大提高。
研究建立了自動檢測明場圖像中球體的流程，并通過使用不同數據子集微調模型來驗證分割的穩健性。評估顯示，當使用所有敏感模型圖像組合訓練時，獲得的F1分數與使用自身圖像訓練時一樣高，且不同時間點的F1分數非常相似，表明治療不影響分割結果。手動測量和AI確定的直徑之間存在良好的相關性，且球體在二維圖像中確實是圓形的。
研究人員還測試了使用所有四個敏感腫瘤訓練的AI模型是否能準確確定耐藥腫瘤的治療反應。比較不同訓練方法獲得的球體測量值，發現使用敏感模型訓練的AI模型表現最佳，因此決定使用該模型進行分析。
球體測量報告敏感和耐藥腫瘤的預期治療反應
為了驗證檢測方法是否能準確報告治療反應，研究人員分析了未經處理及經奧拉帕尼、順鉑和輻射處理的敏感和耐藥球體的明場圖像，并測量了它們的表面積。將所有條件下測量的表面積歸一化至第0天的相應平均面積。
在所有四個敏感腫瘤中，發現奧拉帕尼處理的球體表面積大多低于未處理球體面積分布的第25百分位數，表明大多數球體對治療有反應。相反，奧拉帕尼處理的耐藥球體與未處理球體大小相似或更大，表明它們對治療沒有反應。敏感球體中，奧拉帕尼處理的球體在治療后表面積減少最多，這與先前發現的細胞死亡程度和對細胞增殖的影響一致。但奧拉帕尼反應是可變的。
敏感和耐藥球體對放療的反應是混合的。總體而言，敏感和耐藥球體對放療均表現出部分反應。順鉑治療的效果變化最大。敏感球體在順鉑處理后尺寸顯著減小，但有些敏感球體與未處理球體大小相似。大多數耐藥球體對順鉑治療沒有反應。
總體而言，耐藥球體對奧拉帕尼和順鉑的反應與敏感球體不同，表明球體表面積的測量可以反映腫瘤預期的體內反應。此外，結果表明敏感腫瘤平均對奧拉帕尼治療反應最顯著。
區分治療敏感和耐藥腫瘤
研究證明該檢測方法能夠報告敏感和耐藥球體模型之間治療反應的差異。為了區分敏感和耐藥腫瘤，研究人員首先分析了未處理敏感模型中球體面積的歸一化頻率分布，該分布呈高斯分布。然后使用穩健回歸和異常值去除方法識別并移除異常值，確定未處理條件下的球體大小預期分布，并將閾值設定為平均值減去2個標準差，以定義應答者和無應答者。
結果顯示，敏感和耐藥模型之間對奧拉帕尼的敏感性預測存在明顯差異，敏感模型平均有78.3%的球體有反應，而耐藥模型僅為13.9%。放療后，敏感和耐藥模型之間應答球體的百分比無顯著差異。順鉑治療后，敏感和耐藥模型之間應答者的百分比也沒有顯著差異，這可能是因為在敏感球體中觀察到的對順鉑的部分反應。這些結果強調，盡管平均反應可能顯示敏感性，但相當大比例的球體可能沒有反應，強調了腫瘤反應的變異。基于對奧拉帕尼、順鉑和放療的比較，可以得出結論，奧拉帕尼是這些敏感腫瘤的最佳治療選擇。
研究結論與意義
本研究開發了一種基于球體大小作為治療反應衡量指標的高通量檢測方法，用于功能性乳腺癌精準醫療。功能精準腫瘤學對癌癥治療結果極具價值，但將檢測方法應用于臨床仍需克服重大挑戰，包括模型模擬復雜腫瘤微環境的局限性、用于測試的患者樣本量有限以及治療預測的讀數有限。
與類器官和組織外植體相比，球體形成需要從腫瘤中分離細胞，破壞了組織結構和原生腫瘤微環境，且球體不會自發地重現原生腫瘤微環境。但球體模型可以通過形成來自分離的腫瘤、基質和免疫細胞的混合球體來包含腫瘤微環境的其他組分。本研究僅使用含有腫瘤細胞的球體，足以將敏感和耐藥球體的治療反應與小鼠預期體內治療反應相關聯，且該檢測與更復雜的球體模型兼容。
在大多數情況下，患者腫瘤的活檢組織將是功能檢測的唯一可用材料，因此材料量有限，對基于球體的功能檢測提出了挑戰。球體在短時間內形成和處理，無法擴展材料。本研究每個條件形成和處理256個球體，但每個腫瘤樣本僅提取約60個球體的數據，理論上如果能夠分析所有形成的球體，可以使用減少75%的起始材料。未來需要優化該檢測方法，以證明其與患者腫瘤活檢有限材料的兼容性。
對于功能精準腫瘤學成功應用于臨床，功能檢測應提供清晰的讀數，且最好相當省力且成本低。由于腫瘤異質性和讀數的變異，更多數據點可能使功能檢測更可靠。球體培養非常適合高通量檢測，特別是隨著大規模球體生產方案的最新發展。高通量功能檢測的挑戰在于開發合適的讀數。
本研究使用球體大小作為治療反應的讀數，它受細胞死亡和增殖的影響，并允許在不同時間點對相同球體進行縱向監測。通過使用深度學習實現自動球體分割，建立的分析流程適合大規模藥物篩選。總體而言，球體測量準確地報告了對治療的敏感性，特別是奧拉帕尼治療，可以清楚區分敏感和耐藥腫瘤模型。
然而，基于球體大小，敏感球體對順鉑表現出部分反應，而細胞凋亡染色顯示順鉑處理的敏感和耐藥球體之間存在顯著差異。這些觀察結果可能是由于順鉑劑量不足，導致細胞殺傷效應，而一部分反應性較差的腫瘤細胞保持增殖。球體細胞凋亡標記物的全包染色是一項勞動密集型檢測，需要共聚焦成像和分析，不易在臨床中大規模實施。但將細胞凋亡讀數添加到球體測量中，可以更深入了解治療反應。
為促進球體測量的大規模評估，自動球體分割很有價值，但也具有挑戰性。雖然未來研究可通過自動圖像采集減少圖像變異性，但檢測需要強大的工具來量化圖像。通過實施顯微鏡優化的Segment Anything模型，實現了跨不同腫瘤模型的穩健自動球體分割，高F1分數證明了該方法無需模型特定訓練的廣泛適用性。自動分析流程能夠高效處理大規模球體篩選數據，具有廣泛應用潛力。
總之，該研究描述了一種使用球體和深度學習自動分析治療反應的高通量治療預測檢測方法，可適用于患者腫瘤活檢的功能精準腫瘤學。研究使用患者來源異種移植模型開發和驗證球體檢測，但這些模型可能引入宿主生物體和異種移植體之間的生物學不匹配，限制了其對患者腫瘤的生物學代表性。因此，需要進一步研究該檢測方法對功能精準腫瘤學的潛在價值，包括研究從切除/活檢材料形成的球體的治療反應與患者結局之間的相關性。
