肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)作為一種常見的呼吸道致病菌，是全球范圍內導致兒童和老年人高發病率及死亡率的主要原因之一。盡管肺炎鏈球菌結合疫苗(PCVs)已在全球廣泛接種，但由于抗生素耐藥性問題日益嚴重以及疫苗血清型覆蓋范圍的局限性，肺炎鏈球菌感染依然是一個嚴峻的公共衛生挑戰。這種細菌的致病性高度依賴于其最外層的莢膜多糖(Capsular Polysaccharide, CPS)結構。莢膜猶如細菌的“隱形斗篷”，能幫助細菌逃避宿主補體系統的攻擊、抵抗抗菌肽(Antimicrobial Peptides, AMPs)的殺傷、阻礙吞噬細胞的吞噬作用，并降低其對上皮細胞的黏附，從而促進細菌的播散。鑒于莢膜在肺炎鏈球菌致病過程中的核心作用，它成為一個極具吸引力的藥物靶點。研發針對莢膜而非直接殺死細菌的抗毒力藥物(Anti-virulence drugs)，有望成為對抗耐藥菌感染和應對疫苗血清型缺口的一種替代策略。

在此背景下，發表于《Communications Biology》的一項研究，由顧三偉、張健等研究人員完成，他們從包含800種化合物的小分子庫中篩選出一種有潛力的莢膜抑制劑——甜菊苷(Stevioside)。這是一種從甜葉菊(Stevia rebaudiana)中提取的天然有機分子。研究人員開展了一系列實驗，探究甜菊苷是否能有效抑制肺炎鏈球菌莢膜的生物合成，并闡明其作用機制，最終評估其在體內外對抗感染的有效性。

為開展研究，作者團隊運用了多項關鍵技術方法，包括：基于LC-MS（液相色譜-質譜聯用）的非靶向代謝組學分析，用于探究甜菊苷對細菌整體代謝譜的影響；通過尿酸測定法和酚硫酸法定量分析莢膜多糖產量；采用FITC-葡聚糖排除實驗和透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy, TEM)直觀觀察和測量莢膜厚度與形態；通過定量檢測細胞內丙酮酸水平、NAD⁺/NADH比值和ATP水平來評估細菌能量代謝狀態；利用時間殺傷曲線法評估甜菊苷對LL-37和粘菌素抗菌活性的增敏作用；通過免疫熒光法分析補體成分C3b/iC3b和膜攻擊復合物C5b-9在菌體表面的沉積情況；利用細胞模型（A549肺上皮細胞、RAW 264.7巨噬細胞系和小鼠原代腹膜巨噬細胞）進行細菌黏附和吞噬實驗；并最終利用大蠟螟(Galleria mellonella)幼蟲感染模型和小鼠肺炎模型評價甜菊苷的體內保護效果。

研究首先證實，甜菊苷在有效濃度范圍內對肺炎鏈球菌標準株D39的生長沒有抑制作用。通過尿酸測定和酚硫酸法分析發現，甜菊苷能劑量依賴性地減少莢膜多糖的產量。FITC-葡聚糖排除實驗直觀顯示，甜菊苷處理導致細菌周圍的莢膜厚度顯著減小。透射電鏡觀察進一步提供了確鑿證據：甜菊苷處理后的D39鏈球菌，其表面的多糖莢膜在數量和密度上均明顯減少，莢膜鏈長變短，且出現異質性和稀疏的顆粒結構。重要的是，這種抑制作用在不同培養基條件下均能發生，并且對多種血清型（1型、6A型、22F型、5型和6B型）的肺炎鏈球菌均有效，表明甜菊苷可能是一種廣譜的肺炎鏈球菌莢膜抑制劑。

為了探究甜菊苷抑制莢膜合成的機制，研究人員進行了非靶向代謝組學分析。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)顯示，甜菊苷處理組的細菌代謝譜與對照組顯著分離。他們鑒定出202種差異代謝物，KEGG通路富集分析顯示，這些代謝物顯著富集于氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝等通路。網絡分析進一步揭示，丙酮酸是連接這些富集通路的核心代謝物，且其水平在甜菊苷處理后顯著降低。定量分析證實，甜菊苷劑量依賴性地降低了細菌內的丙酮酸濃度。由于丙酮酸代謝對于維持NAD⁺/NADH平衡和穩定的能量產生至關重要，研究人員進一步檢測了這些指標。結果顯示，甜菊苷處理雖未改變總NAD(H)池的大小，但導致NADH水平下降，從而使NAD⁺/NADH比值顯著升高，同時細胞內ATP水平也呈劑量依賴性降低。補充外源性丙酮酸或使用缺乏丙酮酸氧化酶SpxB的突變株進行實驗，部分逆轉了甜菊苷對莢膜的抑制作用，并緩解了ATP的消耗，這表明甜菊苷通過干擾丙酮酸代謝影響能量狀態，進而抑制莢膜合成。此外，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)結果顯示，甜菊苷并未顯著影響莢膜合成關鍵基因（cpsA, cpsC, cpsD, cpsE）的轉錄水平，提示其作用可能發生在轉錄后或翻譯水平，主要通過對代謝通路的調控來實現。

位于莢膜菌最外層的多糖莢膜有助于肺炎鏈球菌在致命酸性條件（如溶酶體降解和胃腸道應激）下存活，并保護細菌免受活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的殺傷。如所推測，甜菊苷顯著削弱了莢膜介導的酸休克抵抗能力，在處理組的整個測試期間，細菌生長速率均較低。此外，與對照組相比，經甜菊苷處理的細菌在體外對H₂O₂介導的殺傷作用更為敏感。這些結果表明，甜菊苷通過抑制莢膜，使肺炎鏈球菌對有害應激源（至少包括酸休克和氧化應激）更加敏感。

宿主抗菌肽（如cathelicidin肽LL-37）在抵御細菌入侵的第一道先天免疫防線中扮演著不可或缺的角色。位于細菌表面的莢膜多糖可以通過充當“誘餌”減少到達細菌表面的肽量，從而保護細菌免受抗菌肽的殺傷。與莢膜厚度明顯減少的結果一致，甜菊苷有效降低了莢膜賦予的肺炎鏈球菌對LL-37殺傷的抵抗力，且呈劑量依賴性。值得注意的是，先前研究認識到多粘菌素（一種肽類相關抗菌藥）與LL-37具有相似的細菌結合機制和耐藥策略。盡管甜菊苷并未降低多粘菌素對D39肺炎鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)，但在時間殺傷實驗中，它顯著降低了細菌的存活率。這些結果證明，甜菊苷可以通過抑制莢膜相關的抗菌肽耐藥性，部分促進細菌清除。

補體系統是宿主免疫系統的關鍵組成部分，是抵御肺炎鏈球菌入侵的另一道重要先天防線。莢膜能阻止補體沉積。由于所有補體途徑的激活都會觸發C3b的產生及其與細菌表面的結合，以及隨后的C5b-9膜攻擊復合物(MACs)的形成，研究人員進一步檢測了這些補體成分在細菌表面的沉積。免疫熒光分析顯示，與對照組相比，甜菊苷處理顯著增加了菌體表面的C3b/iC3b沉積水平。一致地，在甜菊苷處理組中也觀察到C5b-9結合量的大幅增加。這些結果表明，甜菊苷通過抑制莢膜，促進了補體激活，從而可能加速宿主免疫系統對肺炎鏈球菌的清除。

莢膜在肺炎鏈球菌感染期間的免疫逃逸中也發揮著不可或缺的作用。帶負電的多糖莢膜不僅通過阻礙細菌與上皮細胞的黏附來促進細菌播散，還通過阻斷吞噬作用和后續的宿主免疫細胞反應來保護細菌免受免疫清除。因此，研究人員分別使用A549細胞進行了黏附實驗，并使用小鼠腹膜巨噬細胞(MPMs)和RAW 264.7細胞進行了吞噬實驗。如所推測，甜菊苷劑量依賴性地增加了附著在A549細胞上的細菌數量。盡管吞噬實驗是在無補體條件下進行的，但結果顯示，在MPMs中，16μg/ml的甜菊苷即可顯著提高細胞內細菌的比例；而在RAW 264.7細胞中，64μg/ml的甜菊苷也顯示出促進作用，這表明不同細胞系的吞噬能力存在差異。吉姆薩染色后的RAW 264.7細胞顯微鏡觀察也顯示，與對照組相比，甜菊苷處理細胞內有更多可見且可計數的被吞噬的細菌。基于這些結果，研究人員推測甜菊苷也可能通過增加補體激活和細菌被吞噬，來改善中性粒細胞對肺炎鏈球菌的調理吞噬作用。

為了初步探究甜菊苷在體內對肺炎鏈球菌感染的影響，研究人員首先進行了大蠟螟致死實驗。接種1×10⁶個D39肺炎鏈球菌導致幼蟲在36小時內死亡率達90%。令人鼓舞的是，使用50 mg/kg的甜菊苷治療將死亡率從90%降低至50%，存活率顯著提高了40%。且單用甜菊苷而不感染不會導致死亡，證實該化合物在體內安全無毒。在感染后6小時，處死幼蟲并檢測血腔中的細菌負荷，發現甜菊苷治療組幼蟲血腔中的細菌載量遠低于對照組，表明在甜菊苷治療下，宿主防御系統實現了更強的細菌清除能力。黑化程度（與昆蟲先天免疫系統反應及病原體負荷相關）在甜菊苷治療組中也顯著減輕。這些結果證明，甜菊苷通過抑制莢膜賦予的致病性，有效保護了大蠟螟免受肺炎鏈球菌感染。

隨后，研究人員進一步使用小鼠模型評估了甜菊苷在致命性肺炎鏈球菌肺炎中的體內治療效果。如預期，每天三次皮下注射50 mg/kg甜菊苷能有效保護小鼠免受感染，延遲死亡時間，并使存活率較溶劑對照組提高44.44%。所有存活小鼠在停藥后均保持存活且狀態良好。相應地，甜菊苷治療組小鼠肺組織中的平均細菌載量比對照組低約10倍。同時，病理學觀察顯示，接種亞致死量肺炎鏈球菌的對照組小鼠肺部出現明顯的暗紅色病變伴血液外滲，組織病理學評估顯示明顯的支氣管肺炎特征，包括嚴重水腫、充血和中性粒細胞浸潤。相比之下，甜菊苷治療大大改善了大體病變和組織病理學損傷。與病理切片觀察到的受限的氣道炎癥一致，甜菊苷治療也顯著降低了肺組織勻漿中炎癥細胞因子IL-6和IL-1β的水平。為了使治療實驗更接近實際應用，研究人員進一步評估了每天一次皮下注射150 mg/kg甜菊苷的治療效果。該治療方案同樣顯著提高了小鼠的存活率，表明該化合物在臨床實踐中具有廣闊前景。

本研究成功鑒定出天然化合物甜菊苷作為一種有效的肺炎鏈球菌莢膜抑制劑，其通過改變丙酮酸代謝，破壞細菌NAD⁺/NADH氧化還原平衡和能量生成，從而抑制莢膜多糖的生物合成。作為一種抗毒力策略，甜菊苷本身不直接殺死細菌，而是通過“解除”細菌的關鍵毒力武器——莢膜，來削弱其致病力。這顯著減弱了莢膜在肺炎鏈球菌感染中的核心免疫逃逸作用，使細菌更易遭受宿主抗菌肽殺傷、補體系統攻擊、吞噬細胞清除以及各種環境應激（如酸性和氧化應激）的影響，最終促進了有效的宿主免疫清除。

該研究的發現具有重要意義：首先，它為解決肺炎鏈球菌，特別是耐藥菌和非疫苗血清型感染問題，提供了一種全新的、有別于傳統抗生素和疫苗的干預策略。其次，研究揭示了靶向細菌代謝通路（尤其是丙酮酸代謝）來調控毒力因子合成的新機制，為后續開發針對其他病原體的抗毒力藥物提供了新思路。最后，甜菊苷作為一種天然產物，具有較好的安全性基礎，為其進一步的臨床前和臨床開發奠定了良好基礎。總之，這項研究為開發莢膜靶向治療策略以及利用甜菊苷這一有前景的候選化合物來應對肺炎鏈球菌感染鋪平了道路。