《Cell Death Discovery》：FDX1-mediated cuproptosis promotes cholestatic liver injury exacerbated by taurocholic acid-enhanced copper accumulation
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本研究針對膽汁淤積性肝損傷中銅超載的致病機制，通過臨床隊列分析、動物模型和細胞實驗，首次揭示taurocholic acid（TCA）通過增強肝細胞銅蓄積加劇FDX1介導的銅死亡（cuproptosis）過程。研究發現銅螯合劑tetrathiomolybdate（TTM）和smoothened激動劑（SAG）能有效緩解肝損傷，為臨床治療提供了新靶點。該成果發表于《Cell Death Discovery》，為膽汁淤積性肝損傷的發病機制提供了全新視角。
當我們談論肝臟疾病時，膽汁淤積性肝損傷是一個不容忽視的嚴重問題。這種疾病主要表現為肝細胞長期暴露在高濃度膽汁成分中，是多種肝膽疾病的共同病理特征。盡管現有治療方法不斷進步，但患者長期生存仍面臨嚴峻挑戰。有趣的是，作為人體銅排泄的主要途徑，膽汁淤積是否會通過銅代謝紊亂參與肝損傷的發生？這個科學問題一直懸而未決。
近日發表在《Cell Death Discovery》雜志上的一項研究，為我們揭開了這個謎題的神秘面紗。研究人員通過系統的實驗設計，首次闡明了銅超載在膽汁淤積性肝損傷中的關鍵作用，并發現了一種名為taurocholic acid（TCA）的膽汁酸成分能夠加劇這一過程。
為了回答這些科學問題，研究團隊運用了多種先進的技術方法：首先開展了包含80,519例兒科患者的回顧性臨床研究，分析血清銅水平與膽汁淤積標志物的相關性；其次利用膽管結扎（BDL）大鼠模型模擬膽汁淤積條件，并通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析膽道閉鎖（BA）患者肝組織；在細胞水平上，采用大鼠BRL 3A和小鼠AML12肝細胞系建立銅超載模型，通過RNA測序進行轉錄組分析；同時使用蛋白質印跡（Western blot）、免疫熒光和代謝通量分析等技術評估銅死亡相關標志物的表達和功能變化。
Elevated serum copper levels in children with cholestasis
研究團隊首先對80,519名兒科患者的臨床數據進行了回顧性分析。結果顯示，與γ-谷氨酰轉移酶（GGT）正常組相比，GGT升高組的血清銅水平顯著上升（16.3 μmol/L vs. 15.7 μmol/L），同時伴有丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、直接膽紅素（DBIL）和總膽汁酸（TBA）的升高。這一發現提示銅代謝紊亂可能是膽汁淤積性肝損傷的一個新特征。
ScRNA-seq analysis reveals decreased FDX1 expression in hepatocytes of pediatric cholestasis patients
通過對膽道閉鎖（BA）患者的肝組織進行單細胞RNA測序分析，研究人員發現BA來源的肝細胞中FDX1（ferredoxin 1）表達顯著下調。FDX1作為銅死亡的關鍵調控因子，其表達下降提示銅死亡可能參與了膽汁淤積性肝損傷的發病過程。
Obstructive cholestasis induces dysregulated copper homeostasis with concomitant liver injury and cuproptotic changes in rats
在膽管結扎（BDL）大鼠模型中，研究人員觀察到血清和肝組織銅水平顯著升高，同時伴有肝損傷標志物（GGT、ALT、AST）和TBA的上升。組織學分析顯示BDL大鼠出現明顯的膽管周圍纖維化和肝實質銅沉積。蛋白質印跡結果進一步證實，銅死亡相關標志物DLAT（dihydrolipoamide S-acetyltransferase）、DLST（dihydrolipoamide S-succinyltransferase）、LIAS（lipoic acid synthetase）和FDX1的表達均出現下調，這與銅死亡的特征性調控模式相符。
High copper intake exacerbates BDL-induced liver injury and fibrogenesis, while TTM ameliorates hepatic pathology in rat
為了進一步驗證銅在膽汁淤積性肝損傷中的致病作用，研究人員設置了三個實驗組：正常飲食組（BDL+ND）、高銅飲食組（BDL+HCD）和銅螯合劑tetrathiomolybdate（TTM）治療組（BDL+TTM）。結果顯示，高銅飲食顯著加劇了BDL引起的肝損傷、膽管周圍纖維化和銅沉積，而TTM治療則有效緩解了這些病理變化。Western blot分析進一步證實，高銅飲食誘導的銅死亡調控因子FDX1、DLAT、DLST和LIAS的下調均被TTM處理所改善。
Copper chloride and copper ionophore trigger cuproptosis in rat hepatocytes via copper overload-dependent pathways
在體外實驗中，研究人員使用CuCl2和銅離子載體elesclomol（ES）處理大鼠BRL 3A肝細胞，模擬膽汁淤積肝臟中銅超載的肝細胞。結果顯示，CuCl2和ES以濃度依賴性的方式降低細胞活力，并誘導細胞內銅積累。Western blot分析顯示銅死亡相關蛋白（DLAT、脂酰化DLAT、DLST、LIAS、FDX1）表達顯著下調，同時DLAT單體減少而寡聚化形式增加。免疫熒光證實DLAT的線粒體定位，且表達降低、寡聚化增加。代謝分析顯示三羧酸循環功能受損，氧消耗率（OCR）測定表明基礎呼吸、最大呼吸和ATP產生均顯著降低。
Taurocholic acid exacerbates CuCl2- and copper ionophore-induced cell death via enhanced copper accumulation
研究人員進一步探討了膽汁酸對銅誘導肝細胞死亡的影響。結果顯示，taurocholic acid（TCA）顯著加劇了Cu/ES誘導的細胞活力下降，這一效應被TTM處理所減弱。值得注意的是，TCA干預進一步下調了銅死亡標志物的蛋白水平，并增強了細胞內銅水平和細胞銅積累。這些發現表明TCA通過促進細胞銅積累來增強Cu/ES誘導的肝細胞銅死亡。
Smoothened signaling suppression mediates copper-induced hepatocyte death
通過RNA測序分析，研究人員發現Cu/ES處理的細胞出現了顯著的轉錄組重編程，而TCA聯合處理則進一步加劇了這種變化。基因本體（GO）富集分析顯示，Cu/ES處理細胞中下調的基因顯著富集在smoothened信號通路（GO:0007224）。實驗驗證表明，smoothened激動劑（SAG）處理顯著改善了細胞毒性效應，逆轉了銅誘導的DLAT下調，恢復了SMO及其下游調控因子GLI1和GLI2的表達。
1 and q value<0.05), showing the top 10 enriched biological processes(D,E).F,G BRL 3A cells were treated with SAG, or treated with SAG/CuCl2(150μM)/ES(40 nM), or treated with SAG/CuCl2(300μM)/ES(40 nM) in SAG concentration gradients(0-4.5μM) for 24 h. Line plots of CCK-8 assay for fold cell viability, relative to control group(F; n=3), and RT-qPCR of SMO,GLI1 and GLI2, normalized to the control group(G;n=3).H Western blot of DLAT,LIAS,FDX1 and SMO after BRL 3A cells were treated with CuCl2(150μM) and ES(40 nM) in combination with SAG(2.5μM) for 24 h. Right: fold change in protein expression relative to control group. Data are mean±SD. One-way ANOVA with Sidak's correction(F) and two-way ANOVA with Sidak's correction G,H Abbreviations: PCA principal component analysis,DEGs differentially expressed genes, FPKM fragments per kilobase million, SAG smoothened agonist.'>
FDX1 plays a complex regulatory role in hepatocyte cuproptosis
通過功能獲得和功能喪失實驗，研究人員發現FDX1在肝細胞銅死亡中扮演復雜調控角色。有趣的是，FDX1敲低對細胞活力沒有顯著影響，而FDX1過表達則顯著增強了肝細胞對銅死亡的抵抗能力。機制上，FDX1過表達在銅超載條件下上調了DLAT、LIAS和脂酰化DLAT的蛋白表達，這可能是表型觀察的分子基礎。
這項研究的重要意義在于首次建立了FDX1介導的taurocholic acid加劇銅死亡與膽汁淤積誘導的肝毒性之間的直接聯系。研究發現不僅揭示了銅超載誘導的銅死亡在膽汁淤積性肝損傷中的關鍵作用，還發現了TCA通過增強細胞銅積累而加劇這一過程的新機制。更為重要的是，研究確定了smoothened信號通路在銅死亡中的調控作用，并驗證了TTM和SAG作為治療膽汁淤積性肝損傷的潛在候選藥物。
這項研究的發現為理解膽汁淤積性肝損傷的分子機制提供了全新視角，也為開發針對銅死亡通路的新型治療策略奠定了理論基礎。未來針對FDX1和smoothened信號通路的深入研究，可能為膽汁淤積性肝損傷患者帶來新的希望。
