《Cell Death Discovery》：Unveiling the toxic effects of perfluorooctanoic acid on osteoblast function and extracellular matrix deposition using 2D and 3D models
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本研究針對全氟辛酸（PFOA）暴露與骨質疏松風險增加的相關性，利用2D（增殖期）和3D（分化期）人胎兒成骨細胞（hFOB1.19）模型，系統探討了PFOA對成骨功能的毒性作用。研究發現，PFOA暴露呈現非單調的劑量和時間依賴性效應：在2D模型中主要損害抗氧化防御（CAT、NRF2下調）而不直接影響鈣沉積；在3D類器官中則破壞形態結構，并差異化調節膠原（COL1A2）降解和大麻素受體1（CB1）水平。該研究為理解PFOA破壞骨穩態的復雜機制提供了新視角，強調了利用3D模型評估環境污染物骨毒性的重要性。
骨骼，這個支撐我們身體的精密結構，正悄然面臨著一類新型環境污染物的威脅——全氟和多氟烷基物質（PFAS）。其中，全氟辛酸（PFOA）因其在環境和人體中的高度持久性而備受關注。越來越多的證據表明，PFOA暴露與骨密度降低和骨質疏松風險增加存在關聯，這提示骨骼是PFAS的一個重要靶器官。骨質疏松作為一種常見的代謝性骨病，嚴重影響全球數億人的健康，尤其困擾著老年和絕經后女性群體，給社會帶來巨大的醫療和經濟負擔。然而，PFOA究竟在成骨細胞（負責骨基質分泌的細胞）生命周期的哪個階段（增殖期還是分化期）造成最顯著的損害，其具體分子機制又如何，目前仍不明確。
為了解決這一關鍵科學問題，由Fiorenza Sella和Caterina Licini共同領導的研究團隊在《Cell Death Discovery》上發表了他們的最新研究成果。他們創新性地采用2D和3D兩種人胎兒成骨細胞（hFOB1.19）培養模型，分別模擬成骨細胞的增殖期和分化期，深入探究了不同濃度PFOA暴露的毒性效應。研究的主要假設是PFOA可能通過干擾氧化應激防御、膠原降解以及內源性大麻素系統（ECS）中的大麻素受體1（CB1），差異化地影響不同生理階段的成骨細胞穩態和細胞外基質（ECM）沉積。
為了開展這項研究，研究人員運用了幾個關鍵技術方法。研究核心是使用了hFOB1.19人胎兒成骨細胞系。他們分別建立了2D單層培養模型（用于研究增殖期）和通過懸滴法形成的3D骨細胞球體模型（用于研究分化期）。細胞活性分別通過MTT法（2D）和鈣黃綠素/碘化丙啶（Calcein/PI）活死染色（3D）進行評估。通過顯微鏡成像和ImageJ軟件分析對3D球體的形態學參數（如面積、圓形度、堅實度）進行量化。細胞外基質鈣沉積通過阿爾新紅染色（Alizarin red staining）進行檢測。蛋白質表達水平，包括堿性磷酸酶（ALP）、Runt相關轉錄因子2（RUNX2）、過氧化氫酶（CAT）、核因子E2相關因子2（NRF2）、I型膠原α2鏈（COL1A2）及其降解形式、CB1受體等，均通過蛋白質印跡法（Western Blotting）進行分析。此外，還采用了免疫細胞化學和全貼片免疫熒光技術對組蛋白修飾（H3K9ac, H4K12ac）和CB1的定位進行觀察。
Effects of PFOA on the cell viability of 2D and 3D hFOB1.19 culture
研究人員首先評估了PFOA對細胞活性的影響。在2D培養模型中，MTT實驗顯示，50μM和100μM的PFOA會顯著降低細胞活性，因此后續實驗采用0.1, 1, 10μM這三個濃度。在3D球體模型中，活死染色顯示，暴露2天后，0.1和1μM PFOA即可引起活性輕微但顯著的下降，而10μM, 100μM和1mM濃度則導致活性急劇降低。暴露5天后，所有濃度的PFOA均顯著降低細胞活性，其中1mM被確定為半數致死劑量（DL50）并被排除在后續實驗之外。這些結果一致表明PFOA對成骨細胞具有劑量依賴性的細胞毒性。
Impact of PFOA on 3D hFOB1.19 morphology
PFOA對3D成骨細胞球體的形態產生了顯著影響。暴露2天后，所有濃度的PFOA均顯著降低了球體的圓形度（Circularity）和堅實度（Solidity），并且0.1至100μM的PFOA還增大了球體的面積。暴露5天后，0.1和100μM PFOA處理組依然表現出面積增大、圓形度和堅實度下降；而1和10μM處理組則表現為圓形度和堅實度的顯著降低，但面積無顯著變化。這些形態學改變表明PFOA破壞了骨球體的正常結構發育。
The effects of PFOA on calcium deposition during bone cell proliferation and differentiation
阿爾新紅染色結果顯示，在2D培養（增殖期）中，PFOA暴露并未引起鈣結節沉積的顯著變化。在3D球體（分化期）中，暴露2天的PFOA處理也未影響鈣化。然而，當暴露時間延長至5天時，0.1μM的低濃度PFOA反而顯示出降低礦化百分比的趨勢（p=0.052），而100μM的高濃度處理則表現出礦化增加的跡象，呈現出非單調的劑量效應關系。這表明PFOA在成骨細胞分化期對鈣沉積的影響具有時間和劑量特異性，低劑量長期暴露可能損害礦化過程。
The effects of PFOA exposure on osteogenesis during the proliferation phase
在2D增殖期模型中，PFOA暴露并未顯著改變成骨分化關鍵標志物的水平。堿性磷酸酶（ALP）的蛋白水平和ALP陽性區域面積均無顯著變化。調控成骨分化的關鍵轉錄因子RUNX2的蛋白水平也未受PFOA影響。此外，與基因轉錄激活相關的組蛋白修飾（H3K9ac和H4K12ac）的乙酰化水平在PFOA暴露后也保持不變。這些結果表明，在增殖期，PFOA并未直接干擾成骨分化標志物的表達或相關的表觀遺傳修飾。
The effects of PFOA exposure on bone oxidative stress
氧化應激是PFOA毒性的一個重要機制。在2D模型中，所有測試濃度的PFOA均顯著降低了過氧化氫酶（CAT）的蛋白水平。同時，1和10μM PFOA也下調了核因子E2相關因子2（NRF2）的蛋白表達。在3D球體中，暴露2天后，100μM PFOA引起CAT水平輕微下降（p=0.07），此下降在暴露5天后變得顯著。與此相反，暴露5天后，100μM PFOA處理組的NRF2水平卻顯著升高。這些發現表明PFOA破壞了骨的氧化平衡：在增殖期（2D）它削弱了抗氧化防御能力（CAT和NRF2均下調）；而在分化期（3D），高濃度PFOA初期引起CAT下降，但長期暴露可能觸發了NRF2介導的代償性保護反應。
Effects of PFOA on bone extracellular matrix
研究人員進一步探究了PFOA對細胞外基質關鍵成分I型膠原α2鏈（COL1A2）及其潛在調控因子CB1受體的影響。在2D培養中，10μM PFOA顯著降低了COL1A2和CB1的蛋白水平。在3D球體中，情況更為復雜：暴露2天后，100μM PFOA顯著增加了CB1的水平，同時伴隨著降解形態的COL1A2（60 kDa）水平的降低（p=0.07）。暴露5天后，100μM PFOA組的CB1水平恢復至對照組水平，降解膠原水平也無顯著變化；而0.1μM PFOA則顯著增加了降解膠原的水平，但與CB1變化無關。免疫熒光染色證實了CB1受體在成骨細胞膜上的定位。這些結果提示，PFOA可能主要通過膠原相關通路影響ECM，而CB1可能在此過程中，特別是在分化早期，扮演了某種角色，但其精確機制有待闡明。
綜上所述，本研究揭示了PFOA對成骨細胞功能和細胞外基質沉積產生相依賴性和時間依賴性的非單調效應。在模擬增殖的2D模型中，PFOA主要損害抗氧化防御體系（CAT、NRF2下調），但不直接影響成骨分化標志物和鈣沉積。在模擬分化的3D球體模型中，PFOA則破壞了球體的正常形態結構，并以復雜的劑量和時間模式影響鈣沉積、CB1受體水平和膠原降解。特別值得注意的是，低濃度（0.1-1μM）PFOA主要通過損害礦化和改變蛋白表達來破壞骨穩態，而高濃度（10-100μM）則表現出更強的細胞毒性并損害抗氧化防御。這些發現強調了在評估環境污染物骨毒性時，需要結合2D和3D模型，并考慮不同暴露劑量和時間的綜合影響。該研究為理解PFOA破壞骨穩態的復雜機制提供了新的實驗證據，突出了內源性大麻素系統（特別是CB1受體）和氧化應激通路在PFOA骨毒性中的潛在作用，為未來探索相關的干預策略指明了方向。
