《The FEBS Journal》：A Hanks-type bacterial kinase, PknS, directly phosphorylates the alternative sigma factor EcfK to promote resistance to protist predation
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本綜述系統闡述了植物病原菌Xanthomonas citri中Hanks型激酶PknS通過直接磷酸化替代σ因子EcfK（ECF43家族成員），激活VI型分泌系統（T6SS）以抵抗土壤阿米巴捕食的新型信號通路。研究揭示了PknS自磷酸化特性及其激酶結構域保守性，鑒定了EcfK上五個關鍵磷酸化位點（包括σ2結構域T51和連接區T104/T106/S108/S110），并通過結構預測闡明磷酸化介導的RNA聚合酶結合機制。該發現為細菌轉錄調控和病原體-環境互作提供了新視角。
PknS是典型的Hanks型受體激酶，可催化自磷酸化
PknS作為跨膜受體激酶，其胞質區包含激酶結構域，C端周質區具有三個TPR結構域。序列比對顯示PknS激酶結構域具有Hanks型激酶典型的11個保守亞域（I-XI）及關鍵功能模體：負責ATP結合的GxGGMG P-loop、催化環H/YRDXKXXN（其中天冬氨酸為催化殘基）以及包含DFG模體、磷酸受體蘇氨酸和P+1 APE/SPE模體的激活環。體內實驗表明，缺失周質域的截短版本（PknS1–364和PknS1–449）在X. citri細胞中發生磷酸化，而全長PknS在無誘導信號時無磷酸化，提示周質域對激酶活性具調控作用。功能互補實驗證實周質域對PknS介導的T6SS激活不可或缺。
PknS1–364的結構解析
通過篩選人類激酶抑制劑庫，發現CHIR-124與PknS1–364M164A（門控殘基突變體）結合。共晶結構（2.1 ?分辨率）顯示PknS采用經典Hanks型激酶折疊：N端葉以β鏈為主，C端葉以α螺旋為主，通過鉸鏈區連接形成ATP結合位點。結構比對顯示PknS與結核分枝桿菌PknA/PknB及人類BRAF激酶具有相似性（RMSD 1.5-2.0 ?）。CHIR-124通過喹啉酮基團與鉸鏈區Leu167主鏈形成氫鍵，其苯基咪唑和喹啉酮與Ile91、Val99等殘基發生疏水相互作用。門控突變M164A擴大了ATP結合口袋容積，而野生型PknS則與更小分子Tyrphostin 9結合，表明其結合位點具有立體選擇性。
PknS直接磷酸化ECF σ因子EcfK
體外磷酸化實驗證實PknS1–364可直接磷酸化EcfK，質譜檢測到最多五個磷酸化事件。LC-MS/MS分析鑒定出五個磷酸化位點：保守σ2結構域內的T51，以及連接σ2與σ4結構域的非保守區T104、T106、S108和S110。其中T106在ECF43家族中高度保守（76.9%成員含Ser/Thr或帶負電荷殘基）。與霍亂弧菌EcfP僅有一個磷酸化位點（對應T51）不同，EcfK存在多位點磷酸化調控。
磷酸化的生物學效應：T51和T106位點突變 abolish EcfK激活
通過阿米巴捕食實驗評估EcfK突變體功能，發現雙突變體ecfKT51A/T106A完全喪失抵抗捕食能力，而其他雙突變體（T51A/T104A、T51A/S108A、T51A/S110A）仍具功能。表明T51或T106任一磷酸化即可激活EcfK。免疫印跡驗證突變體蛋白穩定性未受影響。
EcfK Thr106磷酸化對RNA聚合酶相互作用的關鍵作用
AlphaFold 3預測X. citri全酶復合物結構顯示，磷酸化T106（pThr106）位于RpoC表面正電荷口袋內，可能與Arg322和Lys325形成氫鍵。相比之下，pThr51雖與RpoC Arg297相互作用，但其周圍極性殘基（Arg33、Gln49等）可形成替代性氫鍵網絡，解釋T51A突變體仍具功能的原因。對比其他X. citri σ因子發現，其中六個在等效位置含帶負電荷殘基，模擬pThr106的相互作用模式。
討論
本研究揭示了PknS-EcfK-T6SS信號通路在細菌環境適應中的新穎調控機制。與結核分枝桿菌SigH磷酸化不同，ECF43家族σ因子可能通過單一位點（如V. parahaemolyticus EcfP）或雙位點（如X. citri EcfK）磷酸化實現激活，這種差異可能影響信號響應動態范圍。PknS周質域在激酶激活中的調控作用及其在捕食信號感知中的功能有待進一步探索。該研究為細菌轉錄調控及病原體-環境互作提供了新的分子視角。
