《The FEBS Journal》：Phycocyanobilin biosynthesis in Galdieria sulphuraria requires isomerization of phycoerythrobilin synthesized by bilin reductases
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這篇綜述揭示了嗜硫原球藻（Galdieria sulphuraria）通過獨特的PEB:PCB異構酶途徑合成藻藍膽素（PCB）的機制，解決了該紅藻僅含PEB合成酶基因（PEBA/PEBB）卻主要積累PCB的長期悖論。研究通過系統發育分析和酶學驗證，證實GsPEBA/GsPEBB嚴格遵循經典PEB合成路徑，而PCB形成依賴于分子量>60 kDa的蛋白復合物催化的異構化反應。該發現拓展了對紅藻門膽素代謝進化可塑性的認知，為光合色素工程提供了新視角。
引言
藻膽蛋白（PBPs）是藍藻和紅藻捕光復合體的關鍵組分，其功能依賴于共價結合的線性四吡咯發色團（膽素）。嗜硫原球藻（Galdieria sulphuraria）作為早期分支的紅藻，其藻膽體主要包含結合藻藍膽素（PCB）的別藻藍蛋白（APC）和藻藍蛋白（PC），但基因組中僅存在藻紅膽素（PEB）合成酶基因PEBA和PEBB，而缺乏直接合成PCB的PcyA同源酶。這一矛盾暗示了PCB可能存在非典型生物合成途徑。早期研究曾提出G. sulphuraria可能存在將PEB異構化為PCB的酶活性，但其分子基礎至今未明。
PEB向PCB的異構化
研究首先通過硫酸銨分級沉淀、藍色瓊脂糖親和層析和尺寸排阻色譜，從G. sulphuraria中富集到分子量>60 kDa的蛋白組分。該組分在添加外源PEB后，通過光譜分析監測到544 nm（PEB特征吸收峰）向619 nm（PCB特征吸收峰）的轉化，80分鐘內基本完成反應。HPLC進一步證實產物中PCB的生成，且PEB衰減與PCB生成速率相近（kapp≈0.015 min?1）。對照實驗（熱滅活蛋白組、緩沖液空白組）均未檢測到異構化活性，表明該轉化是酶依賴性反應。
G. sulphuraria和C. merolae中FDBRs的系統發育分析
為明確G. sulphuraria中FDBRs的功能定位，研究對紅藻FDBR進行了系統發育分析。結果表明：G. sulphuraria的PEBA（GsPEBA）和PEBB（GsPEBB）分別聚類于PEBA和PEBB進化枝，而與其親緣關系相近的Cyanidioschyzon merolae則含有典型的PcyA（CmPCYA）。系統發育樹還顯示，紅藻和隱藻的PCYA序列形成獨立分支，而PEBA/PEBB序列與硅藻等含紅藻來源質體的類群聚為一支。這些分析排除了GsPEBA/GsPEBB具有非經典功能的可能性。
早期分支紅藻FDBRs的生化表征
體外酶活實驗證實，重組GsPEBA能以膽綠素（BV）為底物，將其還原為15,16-二氫膽綠素（15,16-DHBV）；GsPEBB則以15,16-DHBV為底物生成PEB。當GsPEBA與GsPEBB共同孵育時，反應終產物仍為PEB，未檢測到PCB生成。相反，CmPCYA可直接催化BV經181,182-DHBV中間體生成PCB。這些結果驗證了系統發育分析的預測，并排除了GsPEBA/GsPEBB直接參與PCB合成的可能性。
討論
本研究通過生化實驗證實G. sulphuraria存在依賴于大分子量蛋白復合物的PEB:PCB異構酶活性，解決了該物種“缺乏PcyA卻積累PCB”的悖論。該異構酶途徑可能廣泛存在于缺乏PCYA的紅藻中（如Rhodophytina亞門），其進化意義在于允許生物體在保留PEB合成能力（用于藻紅蛋白）的同時，通過異構化補充PCB（用于APC/PC）。未來研究需通過蛋白質組學鑒定異構酶組分，并探索其與藻膽蛋白連接酶的協同機制。
材料與方法
研究通過異源表達純化了GsPEBA（His標簽）、GsPEBB（Strep標簽）和CmPCYA（GST標簽），并在厭氧條件下進行酶活檢測。反應體系包含鐵氧還蛋白（PetF）、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶（FNR）及NADPH再生系統。產物經固相萃取和HPLC（C18柱，丙酮-甲酸流動相）分析。系統發育分析采用IQ-TREE和PhyML軟件，以氧依賴性糞卟啉原氧化酶（CPO）為外群。
