組合庫中互補蛋白質對的篩選能夠顯著加速新型或改進的蛋白質-蛋白質相互作用的開發。此類"庫對庫"（LOL）方法已成功應用于Z結構域-親和體對、給定T細胞受體（TCR）的抗原鑒定以及TCR-肽主要組織相容性復合物相互作用、針對HIV-1 gp160蛋白片段的單鏈可變區片段結合劑等領域。當前穩健的LOL設計要么基于單獨使用酵母或聯合噬菌體-酵母系統的表面展示，將兩個伙伴庫呈現在不同的細胞群體上，或將兩個伙伴庫以順式連接在同一細胞表面。這些方法利用了噬菌體和酵母宿主提供的大庫容量，以及使用熒光激活細胞分選（FACS）評估所選相互作用強度的能力。然后可以通過測序鑒定匹配的結合對，將結合功能與序列信息聯系起來。

本研究旨在將LOL方法擴展到工程化具有多重轉換能力的酶。與以往依賴于捕獲相互作用的方案不同，我們感興趣的是開發一種通用方法，靶向與其蛋白質或肽底物瞬時相互作用而不形成穩定復合物的酶。這種方案可能應用于工程化非捕獲型分裂酶系統，其中兩個片段在進化過程中同時被優化，以及作用于蛋白質或肽底物以用于位點特異性標記應用的酶。在這些酶活性中，酶介導的肽標簽標記被廣泛用于生物化學研究中的位點特異性蛋白質修飾、可視化和pull-down測定。常見的酶-標簽對包括金黃色葡萄球菌Sortase A介導的轉肽作用、大腸桿菌硫辛酸連接酶（LplA）及其受體肽（LAP）、以及大腸桿菌生物素連接酶（BirA）及其15個殘基的受體肽（AP或AviTag）。迄今為止，定向進化工作主要集中在單獨提高酶的標記效率或標簽的序列和正交性上。

本文介紹了一個用于酶-標簽對的通用LOL平臺，以BirA-AP作為原理驗證。大腸桿菌BirA是一種ATP依賴性酶，催化生物素共價連接到其天然蛋白質底物BCCP或工程化的AP肽上的特定賴氨酸殘基。BirA催化的AP標簽蛋白的生物素化可以利用強大的生物素-鏈霉親和素相互作用來附加探針，用于成像、固定化和親和純化等多種應用。BirA已被工程化以改變其小分子底物特異性，使其超越生物素，并已被轉化為鄰近標記酶，用于蛋白質的空間限制標記。然而，除了從酵母中開發出一個正交的BirA-AP對外，替代的BirA-AP標簽對的研究要少得多。具有可調反應動力學的額外BirA-AP對可能有助于對不同親和力水平的蛋白質-蛋白質相互作用進行相互作用依賴性標記。因此，我們開發了一個LOL反式標記和隨后的順式標記篩選平臺，并將其應用于篩選新的BirA-AP標簽。

在本研究中，我們首先驗證了野生型（WT）BirA對AP的反式生物素化，并將該測定法應用于篩選針對WT BirA的AP肽變體。接下來，我們進行了AP庫對BirA庫的篩選，以鑒定能被BirA庫變體生物素化的新AP變體。然后，我們利用SpyTag-SpyCatcher共價捕獲在酵母表面開發了一種順式生物素化策略，將靶標AP肽呈遞給BirA庫，從而能夠鑒定針對新AP變體的BirA變體。我們使用反式和順式生物素化測定在酵母細胞上表征了所得的BirA-AP對，并在體外使用高效液相色譜（HPLC）測定法與合成的AP肽和純化的BirA變體進行了表征。據我們所知，這是酶-肽標簽LOL篩選的首次演示，它為進化具有不同活性的酶-肽底物對提供了一個通用框架。

為了促進BirA庫對AP肽庫的篩選，我們使用了基于酵母細胞表面展示的定向進化，因為它允許篩選數百萬個變體、多色表征以及在很寬的活性動態范圍內進行區分。由于酶-底物對通常表現出比穩定的蛋白質-蛋白質相互作用弱得多的親和力，因此需要一種替代的篩選策略來使基于酵母表面展示的LOL篩選適用于酶-底物LOL篩選。

為了在多轉換反應設置中實現酶-底物對的LOL篩選，我們在初始篩選中采用了反式生物素化。為了驗證酵母表面展示系統中的反式生物素化，我們構建了與BirA融合的aga2p，后接HA表位標簽，以及與AP肽融合的aga2p，后接FLAG表位標簽。我們首先測試了以1:1比例混合展示BirA的酵母和展示AP的酵母，最終細胞密度約為10⁸個細胞/mL。在存在生物素的情況下，表達AP的細胞（而非表達BirA的細胞）表現出強烈的生物素化信號。在沒有添加生物素或使用賴氨酸無效失活AP（K10A）的陰性對照中，展示AP的細胞顯示出很少的生物素化。這表明反式生物素化可以發生，并且生物素化特異性地針對AP肽中的受體賴氨酸殘基（K10）。

為了更好地模擬LOL反式標記的情況，即含有特定AP肽或BirA變體的細胞密度要低得多，我們只添加了1%的展示BirA和展示AP的細胞；另外99%的細胞是未誘導的酵母細胞，構成用于反式生物素化標記的最終細胞密度10⁸個細胞/mL。即使在這種稀釋的細胞密度設置下，仍有81%的AP陽性細胞表現出生物素化，表明在AP和BirA陽性細胞密度較低時，反式生物素化仍然有效。相反，在降低的細胞密度10⁷個細胞/mL下，表達AP的細胞未顯示可檢測的生物素化，表明當陽性細胞密度低于某個水平時，反式生物素化不再可能。

為了進一步驗證LOL反式標記篩選平臺的可行性，我們評估了混雜型BirA的反式生物素化標記效率。盡管WT BirA對AP肽具有高度特異性，但突變可能導致BirA對生物素-AMP的親和力降低，導致反應中間體意外釋放，這可能標記鄰近蛋白質并在BirA和AP突變體的篩選中造成假陽性。我們在酵母表面展示了TurboID（一種高活性混雜型BirA），并與展示AP的酵母進行了反式標記。我們觀察到只有總細胞群體的0.41%（以及展示AP細胞的1.4%）顯示出生物素信號，而其余28.8%的總細胞群體沒有生物素標記。TurboID陽性細胞由于鄰近標記（主要局限于酶表達細胞的表面）而進一步表現出強烈的生物素化。這些結果表明，在測試條件下，以TurboID為例的混雜型BirA不會反式標記鄰近細胞。我們還一起混合了展示BirA、TurboID和AP的酵母。正如預期，在存在BirA的情況下，AP陽性細胞顯示出強烈的生物素化。這些結果表明，在測試條件下，諸如TurboID之類的混雜型BirA變體不能有效地反式生物素化鄰近的AP細胞，支持了LOL反式標記篩選方法的特異性。

對于AP庫構建，我們隨機化了直接側接K10受體賴氨酸的六個氨基酸殘基（E7、A8、Q9、I11、E12和W13）。用簡并NNK密碼子隨機化六個殘基產生的AP變體水平接近酵母的轉化效率極限。我們靶向這些殘基是因為圍繞受體賴氨酸的殘基對于跨進化界限的天然底物是高度保守的，并且基于BirA-AP相互作用的結構預測可能對BirA相互作用至關重要。這六個位置用NNK簡并密碼子完全隨機化，產生的理論庫大小與6.1 × 10⁷個突變體的實驗庫大小密切匹配。

與大的AP*庫相比，我們決定構建更聚焦的BirA庫，只隨機化兩個殘基。這確保每個BirA庫變體在10⁸個細胞/mL中以接近1%的密度存在，正如我們之前所確定的。基于AlphaFold3預測的BirA-AP復合物結構，AP中突出的疏水殘基可能對其與BirA的相互作用至關重要。然后我們鑒定了兩組靠近AP中疏水殘基的BirA殘基用于BirA庫構建。在位置P143和A146隨機化的庫被指定為庫1，在位置L191和T195隨機化的庫被指定為庫2，每個庫包含多達400個變體。

我們首先進行了AP庫（AP）對WT BirA的篩選，以證明反式生物素化篩選平臺。如圖所示，設置一個門來選擇AP和生物素化陽性群體。經過一輪篩選后，AP和生物素化陽性群體顯著增加，占AP陽性細胞的7.2%。我們又重復篩選了兩輪，直到92%的AP陽性細胞是生物素化陽性。從富集的酵母細胞中提取DNA進行測序分析。雖然大多數富集的細胞包含WT AP，但也鑒定出兩個獨特的AP變體。AP(E7N)突變體表現出被WT BirA強烈生物素化，與WT AP水平相當，而AP(E7N A8I Q9R I11W E12T W13M)突變體用WT BirA未顯示生物素化。這些發現進一步驗證了基于酵母表面展示的LOL反式生物素化篩選平臺的可行性。

接下來，我們進行了AP庫（AP）對兩個BirA庫（BirA）的LOL反式生物素化篩選。對于BirA*(P143X, A146X)篩選，我們在第一輪分選后未能富集AP陽性和生物素化陽性細胞，并且沒有進一步跟進這個庫。

BirA(L191X, T195X)篩選富集了AP和生物素化陽性群體。經過一輪篩選后，出現了兩個新的AP和生物素化陽性酵母群體。一個群體顯示出與WT AP-BirA信號相當的強烈生物素化信號，另一個顯示出較低的生物素化信號。我們推斷，高度生物素化的群體很可能是由于WT AP的生物素化，因為WT BirA也存在于BirA庫中。相反，具有降低的生物素化的群體更可能是由于新出現的AP–BirA*對。為了避免選擇WT AP，我們在第二輪分選中設置了一個門來只富集具有較低生物素化信號的AP陽性酵母群體。因此，在第二輪分選后，我們移除了大多數類似于WT AP的高度生物素化群體。雖然這種策略有可能錯過一些對BirA突變體具有高活性的AP變體，但它是分離新AP變體的一般有效方法。進行了第三輪分選以富集生物素化陽性細胞，產生了具有高和中等生物素化信號的兩個酵母群體。具有不同生物素化水平的細胞群體的出現強烈表明新的AP變體已被選擇。

從第二輪分選后（AP-S2）和第三輪分選后（AP-S3）富集的酵母中提取DNA進行下一代測序（NGS）分析。DNA也被重新轉化到細菌中進行單個DNA測序分析。AP-S2群體顯示出高序列變異，沒有富集任何特定的突變體，并且正如預期，NGS顯示WT AP僅占總序列讀數的0.25%。大多數WT AP的去除是令人鼓舞的，并驗證了我們最小化庫中WT AP存在的方法。有趣的是，第13位強烈收斂到天然色氨酸，強調了其在AP與BirA相互作用中的關鍵作用。這一發現進一步支持了我們的假設，即疏水殘基對于AP與BirA的結合至關重要。相比之下，AP-S3群體顯示出兩個富集的AP*變體：WT AP和AP(E7R A8T Q9L E12I)。

我們表征了通過單個測序鑒定的與NGS分析結果匹配的單個克隆。我們表征了來自AP-S2的12個變體。正如預期，所有這些變體都表現出低的生物素化信號，與圖3B中的分選結果一致。我們表征了來自AP-S3的五個富集變體。最富集的變體AP(E7R A8T Q9L E12I)顯示出最高的生物素化信號，約為WT AP的0.6倍，而下一個最富集的突變體AP(E7D A8S I11V)產生的生物素化信號是WT AP的0.4倍。

為了鑒定與WT BirA正交的潛在AP*變體，我們評估了它們被WT BirA生物素化的情況，以選擇那些活性低的變體。然而，WT BirA對這些變體表現出更高的活性，這并不奇怪，因為缺乏針對WT BirA的負選擇。我們注意到BirA和AP之間的相互作用是疏水的，并取決于特定的肽結構。這兩個選定的肽可能具有與AP相似的二級結構，使它們能夠適應活性位點并被WT BirA特異性識別。

因此，我們對AP-S3變體進行了針對WT BirA的負選擇。然而，在負選擇之后，剩余的AP變體對BirA庫沒有表現出活性。這表明大多數AP*變體也被WT BirA識別，因此在負選擇過程中被消除。這個結果并不奇怪，因為通常需要漸進的進化行走來顯著改變酶的選擇性；我們僅向BirA庫引入兩個突變可能不足以產生從WT活性的顯著轉變。

在這里，我們的主要目標是證明AP反式生物素化篩選平臺的可行性，并為BirA變體建立篩選方案。因此，我們繼續使用富集的變體進一步篩選對最富集的AP變體具有活性的BirA變體。

在使用反式生物素化平臺鑒定新的AP之后，我們接下來建立了一個順式篩選平臺，以精確定位對特定AP序列進行生物素化的BirA變體。為了便于用不同的AP底物篩選給定的BirA庫，我們將順式篩選平臺設計為模塊化，所需的AP序列以翻譯后方式引入到BirA庫展示的酵母上。為了將AP共價連接到展示BirA的酵母上，我們采用了SpyTag–SpyCatcher系統。將16個氨基酸的SpyTag融合到BirA的C端。AP底物與SpyCatcher基因融合，在大腸桿菌中表達，并作為融合蛋白純化。添加SpyCatcher–AP融合物然后促進了SpyTag和SpyCatcher之間的異肽鍵形成，使AP能夠以順式方式展示在BirA呈遞的酵母表面，并進行隨后的順式生物素化。將用失活（例如，賴氨酸無效）AP融合的SpyCatcher進行負選擇，以消除非特異性標記鄰近蛋白質的混雜BirA變體，而不依賴于AP的存在。這種順式標記篩選方法能夠針對特定的AP肽（如我們初始反式生物素化篩選得到的那些）篩選BirA變體。然而，它不易擴展用于庫對庫的篩選，因為它需要單獨純化每個SpyCatcher–AP融合蛋白。

首先使用WT BirA和AP建立了通過SpyTag–SpyCatcher鍵形成的順式生物素化平臺。我們首先確認了成功的SpyTag–SpyCatcher鍵形成，這通過HA–BirA和SpyCatcher–AP免疫熒光之間的正相關性表明。然后我們通過觀察生物素化信號與共價結合的SpyCatcher–AP水平的關系來表征順式生物素化效率。SpyCatcher–AP肽在存在生物素的情況下被順式展示的WT BirA高度生物素化，但在沒有生物素或SpyCatcher上沒有AP序列（脫靶SpyCatcher）的陰性對照中則不生物素化。總之，這些實驗驗證了順式標記平臺在鑒定對順式展示的AP肽具有活性的BirA變體方面的實用性。

我們接下來表征了兩個選定的最佳SpyCatcher–AP*變體。值得注意的是，我們在無生物素條件下觀察到AP(E7D A8S I11V)的高生物素化背景。該肽的高背景是由于在大腸桿菌中蛋白質表達期間被內源性大腸桿菌BirA生物素化所致。當我們在酵母上使用催化失活的BirA（K183A）進行順式生物素化時，AP(E7D A8S I11V)的高生物素化背景仍然存在，進一步證實觀察到的生物素化發生在酵母實驗之前的步驟中。

然后我們使用兩個AP變體通過順式生物素化對BirA(L191X, T195X)進行篩選。類似地，富集了具有高生物素化信號的BirA*。經過一輪分選后，具有AP(E7R A8T Q9L E12I)和AP(E7D A8S I11V)的生物素化陽性群體分別增加到42.1%和47.2%，高于WT BirA活性水平。

從富集的酵母中提取DNA進行NGS分析。我們觀察到BirA序列中的趨同突變，L191S和T195V突變占總序列的50%以上。最富集的BirA(L191S, T195V)變體在對兩個AP變體肽的篩選之間是共享的。

然后我們通過順式和反式生物素化表征了選定的BirA變體與WT AP和兩個AP變體。在順式生物素化中，所有BirA變體都表現出相似的順式生物素化活性，對兩個AP變體的活性略高于WT BirA，但沒有一個對AP表現出與WT BirA明顯不同的活性。在反式生物素化中，BirA突變體對AP和AP突變體都表現出更大的活性變化。WT BirA、BirA(L191A T195L)和BirA(L191M T195W)對兩個AP變體都顯示出最高的生物素化信號。值得注意的是，BirA(L191M, T195W)對AP(E7R, A8T, Q9L, E12I)產生的信號比陰性對照高21.3倍，比WT BirA高2倍。相比之下，從順式生物素化篩選中最富集的變體BirA(L191S T195V)表現出低得多的反式生物素化信號。

順式和反式生物素化之間不同BirA–AP對生物素化效率的不一致指出了順式生物素化方法的局限性：1） 肽表達過程中內源性大腸桿菌生物素化導致的高背景；2） 限制為單轉換反應，因為BirA和AP已經鄰近，使得篩選高轉換和催化效率具有挑戰性。

為了驗證從反式標記LOL篩選和隨后的順式標記篩選鑒定出的新型BirA–AP對，我們進行了全面的體外酶促生物素化測定。首先在確定的反應條件下，用純化的BirA酶對合成的AP和AP突變肽進行生物素化。反應隨后用EDTA淬滅，并通過HPLC分析得到的生物素化產物。通過HPLC色譜圖中出現生物素化肽峰（其表現出與未反應肽明顯分辨的獨特保留時間）來確認產物形成。我們通過生成肽標準曲線并積分底物（AP）和產物（生物素化AP）峰面積來計算每個反應的百分比轉化率，從而量化酶效率。

體外生物素化結果允許定量比較新進化的BirA–AP對的生物素化。兩個選定的AP變體都被0.1 μM WT BirA有效生物素化，在30分鐘反應下分別產生17.0%和26.3%的轉化率。因為生物素化反應尚未完成，這些條件適用于并排比較特定BirA-AP對的效率。BirA(L191A T195L)、BirA(L191M T195W)和BirA(L191V T195P)都表現出比其他BirA變體更高的體外活性。這一趨勢與酵母細胞表面的反式生物素化結果一致，但與順式生物素化結果不一致，強調了我們的篩選的反式LOL步驟在區分活性和富集催化效率高的BirA–AP對方面的關鍵作用。

我們開發并驗證了一個基于酵母表面展示的LOL反式標記篩選平臺，隨后進行順式標記篩選，能夠發現新型BirA和AP（BirA–AP）對。在反式標記篩選步驟中同時對兩個蛋白質伙伴施加選擇壓力，顯著促進了新型酶-底物對的篩選，為富集高酶活性提供了起點。

作為原理驗證，我們首先在酵母表面建立了反式生物素化測定，確認生物素化特異性地發生在表達AP的細胞上，陰性對照的背景標記可忽略不計。該平臺使我們能夠在大型細胞群體中以低頻率存在陽性BirA-AP對時有效檢測特異性生物素化，這是組合庫中有效高嚴格度篩選的關鍵要求。重要的是，該平臺最小化了由混雜生物素化引起的假陽性，因為反應中間體生物素-5'-AMP一旦從BirA活性位點釋放，其擴散半徑有限（約10 nm）且半衰期短。因此，反式生物素化方法增強了對新肽底物和相應BirA*變體篩選的選擇性和保真度。

LOL篩選的一個顯著挑戰是意外富集WT AP，因為選擇最高的AP活性通常有利于WT BirA或WT BirA樣變體。為了克服這一點，我們進行了三輪FACS分選，并通過選擇具有中等生物素化的AP變體來去除富集的WT AP克隆。雖然這種策略有可能排除具有WT AP活性水平的肽，但為了在進化的AP庫中保持序列多樣性是必要的，并有助于引導我們鑒定出被BirA變體高度生物素化的新型AP*變體。NGS和單個克隆分析揭示了關鍵界面殘基（如W13）的趨同突變，與結構預測和基于疏水性的識別一致。

然而，幾個選定的AP*變體也用WT BirA顯示出高生物素化活性，表明存在持續的交叉反應性。對于旨在實現正交性的未來篩選，LOL篩選應納入負選擇以選擇對抗WT活性。此外，計算蛋白質設計和結構引導的庫構建可以優化界面殘基，并進一步降低WT樣特異性。總之，我們的原理驗證證明LOL篩選可以鑒定出針對特定酶變體定制的新肽底物。

基于SpyTag介導的鍵形成的順式生物素化使BirA和AP都能夠展示在同一酵母細胞表面，允許針對新型肽底物分選活性BirA變體。對兩個新肽底物分別進行單輪FACS分選后，分選后的細胞顯示出比初始BirA庫以及WT BirA增加的生物素化，表明成功篩選出更活躍的BirA*變體。NGS顯示最常見的變體在兩個不同的靶肽之間共享，證實了由于WT樣變體的富集而導致的交叉反應性。

我們觀察到不同BirA–AP對的生物素化效率在順式和反式生物素化方法之間不一致。雖然我們的方法中的順式生物素化允許可行地分選活性BirA變體，但它有局限性，包括肽表達過程中大腸桿菌內源性BirA的高背景信號，這可能導致生物素化信號飽和，而與BirA活性無關，并混淆正選擇。此外，同一細胞上BirA和AP的1:1化學計量只允許單轉換標記，使得提高催化效率具有挑戰性。相反，反式生物素化依賴于細胞-細胞接觸進行肽底物生物素化，并被證明在檢測新進化的BirA–AP對中的活性方面更有效。順式標記方案的兩個潛在改進包括：第一，將BirA–SpyCatcher融合蛋白放在酵母表面，允許使用合成的SpyTag–AP肽，以避免在大腸桿菌制備過程中預生物素化。第二，為了解決當前順式標記方案的單轉換限制，可以將SpyCatcher與Aga1p融合，并引入多個與SpyTag融合的AP*拷貝。

盡管有技術改進，但新BirA和AP對之間的完全進化分化和限制的正交性仍然具有挑戰性。選定的變體通常保留與WT伙伴的交叉反應性，強調了在高度保守的系統中進化蛋白質特異性的復雜性。

我們的LOL反式和順式標記篩選平臺可以廣泛適用于酶-肽標簽發現之外。這種方法可能適用于工程化正交的蛋白質-蛋白質相互作用和受體-配體對，用于合成生物學。例如，在酵母合成信號電路中，LOL篩選可以通過生成具有定制特異性的匹配受體和信號配體來實現信號通路的創建。正交合成基因調節器使得能夠構建可編程的、絕緣的信號轉導網絡，允許在同一細胞中同時部署多個合成電路，并最大限度地減少與內源性系統的串擾。盡管我們的LOL篩選產生了適度的功能增益，但它們證明了這種策略的可行性，并為開發用于下一代合成生物學的日益復雜的正交分子工具奠定了基礎。