《ChemBioChem》：Selection and Characterization of SARS-CoV-2 Spike Binding Clickmers
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本文報道了利用點擊化學(xué)系統(tǒng)進化配體（click-SELEX）技術(shù)成功篩選出靶向SARS-CoV-2刺突（CoV2-S）糖蛋白的化學(xué)修飾DNA適配體（稱為clickmer）。研究通過兩種獨立的“拆分-合并”篩選策略，獲得了分別功能化有苯并呋喃（BF-dU）或吲哚（In-dU）基團的clickmer家族。先導(dǎo)候選分子BF1和N2對野生型CoV2-S具有納摩爾級親和力，并能結(jié)合包括Alpha、Delta和Mu在內(nèi)的多種變異株。通過截短優(yōu)化獲得的31個核苷酸clickmer T2，對Omicron變異株顯示出增強的結(jié)合能力。該工作凸顯了click-SELEX平臺在開發(fā)針對臨床相關(guān)靶標的高親和力、高特異性分子識別工具方面的巨大潛力和應(yīng)用價值。
引言
高親和力分子識別元件的持續(xù)開發(fā)是生物技術(shù)、診斷學(xué)和治療設(shè)計領(lǐng)域的基石。自COVID-19大流行以來，已有大量靶向SARS-CoV-2刺突（CoV2-S）糖蛋白的核酸適配體被報道，包括基于DNA和RNA的序列。然而，它們的相互作用特性受限于經(jīng)典核苷酸有限的化學(xué)多樣性。
為了擴展刺突蛋白結(jié)合寡核苷酸的化學(xué)庫，本研究聚焦于稱為clickmer的化學(xué)多樣化適配體。這些合成適配體用5-乙炔基-2′-脫氧尿苷（EdU）替代胸苷，提供了一個末端炔烴手柄，可通過銅(I)催化的疊氮-炔環(huán)加成（CuAAC）進行正交修飾。這種策略能夠?qū)⒍喾N功能部分（稱為“click-in”）位點選擇性地綴合到核酸骨架上，顯著擴展了適配體支架可及的化學(xué)和功能景觀。
Clickmer是通過一種稱為click-SELEX的適應(yīng)性體外選擇過程產(chǎn)生的，這是成熟的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化（SELEX）方案的改良形式。在click-SELEX中，摻入EdU殘基的寡核苷酸庫通過CuAAC點擊化學(xué)進行化學(xué)多樣化，從而能夠進化出對復(fù)雜靶標（如病毒糖蛋白）具有增強結(jié)合親和力、穩(wěn)定性和選擇性的配體。
本研究報道了結(jié)合CoV2-S糖蛋白的clickmer的選擇和生化表征，證明了具有診斷潛力的高親和力、化學(xué)多樣化clickmer的成功富集。在篩選出的候選物中，我們鑒定了一個特別有效的結(jié)合劑，并通過合理的截短進一步優(yōu)化了其與Omicron變異株的結(jié)合能力。由此產(chǎn)生的最小clickmer T2，盡管序列長度縮短，仍保留了高親和力結(jié)合。重要的是，與先前開發(fā)的未修飾DNA適配體相比，T2也能結(jié)合CoV2-S Omicron變異株，這凸顯了基于clickmer的識別即使在高度突變的刺突蛋白變異株背景下的穩(wěn)健性。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了click-SELEX平臺的多功能性和clickmer作為病毒檢測及其他領(lǐng)域的適應(yīng)性分子工具的實用性。
結(jié)果
CoV2-S結(jié)合Clickmer的選擇與表征
為了鑒定結(jié)合CoV2-S（即在哺乳動物細胞中表達、穩(wěn)定在預(yù)融合構(gòu)象的三聚化His標簽標記的CoV2-S胞外域）的clickmer，我們進行了兩個獨立的拆分-合并點擊選擇（SELEX A和SELEX B），它們在所使用的化學(xué)實體集合和孵育步驟的條件上有所不同。SELEX A旨在模擬唾液條件，以期進化出適用于診斷目的的clickmer。SELEX B在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中進行，旨在選擇用于治療目的的適配體。
經(jīng)過10輪（SELEX A）或8輪（SELEX B）具有遞增嚴格度的選擇后，通過流式細胞術(shù)評估富集的DNA庫的結(jié)合情況。結(jié)果表明，只有在用苯并呋喃（BF-dU，SELEX A）或吲哚（In-dU，SELEX B）進行點擊修飾時，富集的DNA庫才顯示出與CoV2-S的結(jié)合增加。未修飾的DNA或用選擇過程中使用的任何其他殘基點擊的DNA均未檢測到相互作用。
通過下一代測序（NGS）分析DNA種群，并選擇代表性序列BF1、BF2、BF3（來自SELEX A）和N1-N9（來自SELEX B）進行進一步表征。所有測試的序列在以BF-dU（SELEX A候選物）或In-dU（SELEX B候選物）修飾時均顯示與CoV2-S的結(jié)合，而未點擊或以其他化學(xué)實體修飾時則不結(jié)合。濃度依賴性結(jié)合分析顯示，BF-dU修飾的BF1和BF3的平衡解離常數(shù)（KD）分別為87 nM和69 nM。對于SELEX B候選物，在濃度高達500 nM時未觀察到信號強度飽和。相應(yīng)的打亂序列對照未顯示結(jié)合。
對BF1和N2進行了EdU位點重要性評估。通過合成一系列點突變體（將單個EdU殘基替換為胸苷），確定了BF1中8個EdU位點中的5個（位置44、45、48、51、53）和N2中7個EdU位點中的5個（位置48、50、52、55、56）對于CoV2-S結(jié)合至關(guān)重要。基于這些結(jié)果，選擇了保留必要點擊位點的優(yōu)化變體BF1.5和N2.5用于后續(xù)研究。
N2和BF1.5與CoV2-S變異株的結(jié)合表征
接下來檢查了刺突蛋白突變對兩種clickmer結(jié)合能力的影響。使用表達Alpha（B.1.1.7）或Beta（B.1.315）刺突變異株的Flp-In T-REx細胞進行的基于流式細胞術(shù)的結(jié)合實驗表明，N2 clickmer僅與Alpha變異株特異性結(jié)合，而未能與Beta變異株相互作用。BF1.5也顯示出與表達Alpha變異株細胞的結(jié)合，與N2相反，BF1.5表現(xiàn)出與Beta變異株的中等程度結(jié)合。在缺乏刺突蛋白表達的情況下，僅觀察到最小的細胞表面結(jié)合，證實了所鑒定clickmer具有相關(guān)的靶標特異性。
通過表面等離子共振（SPR）測量確定了兩種clickmer與CoV2-S變異株的結(jié)合親和力。將生物素化的clickmer固定在鏈霉親和素（SA）傳感器芯片上，滴定不同濃度的刺突蛋白，得出BF1.5與野生型刺突蛋白的KD為27.8 nM，N2為40.7 nM。將SPR分析擴展到評估BF1.5和N2與Delta（B.1.617.2）和Mu（B.1.621）變異株的結(jié)合親和力。兩種clickmer都與這兩種變異株發(fā)生相互作用，并且有趣的是，與野生型相比，對這些刺突變異株表現(xiàn)出改善的親和力。
為了驗證SPR獲得的親和力常數(shù)，我們采用微尺度熱泳（MST）作為另一種技術(shù)來評估Cy5標記的N2與野生型和Delta CoV2-S的結(jié)合。其變體N2.5也針對Delta CoV2-S進行了測試，以確認去除兩個非必需EdU殘基確實對結(jié)合親和力沒有顯著影響。MST測量結(jié)果與SPR數(shù)據(jù)一致。
N2的截短揭示了與Omicron CoV2-S變異株結(jié)合增強的31個核苷酸Clickmer
接下來測試了clickmer與Omicron CoV2-S變異株（B.1.1.529）的結(jié)合能力。最初的流式細胞術(shù)實驗顯示，N2的結(jié)合顯著降低，而BF1.5則完全喪失親和力。同時，我們觀察到非結(jié)合點擊對照與此變異株的非特異性相互作用增加。
為了提高特異性并可能增強對Omicron刺突蛋白的可及性，基于N2.5預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)（使用NUPACK），合理設(shè)計了幾種N2.5的截短變體。預(yù)測的結(jié)構(gòu)表明了一個包含凸起和發(fā)夾環(huán)的結(jié)構(gòu)化區(qū)域，該區(qū)域帶有共同的基序。因此，我們生成了T1（47 nt）、T2（31 nt）和T3（18 nt）的N2.5截短體，它們顯示出與N2.5完全或部分的結(jié)構(gòu)相似性。我們還通過去除兩個20 nt長的引物結(jié)合區(qū)（PBS）生成了另一個截短體T4，預(yù)計該截短體會部分喪失這一重要的結(jié)構(gòu)元件。
使用流式細胞術(shù)，我們初步評估了每個截短變體與三聚體Delta刺突蛋白的結(jié)合。所有三個變體（T1, T2, T3）都保留了結(jié)合活性，其中T2與全長N2.5相比表現(xiàn)出顯著的結(jié)合增加。T4截短體顯示出結(jié)合強度較N2.5降低，這與預(yù)測的原始二級結(jié)構(gòu)破壞一致。
接下來，我們比較了T2與Omicron刺突蛋白的結(jié)合與N2.5的結(jié)合。作為非結(jié)合對照，生成了T2的打亂版本，稱為T2sc，并使用未修飾的T2來研究其點擊依賴性。如圖所示，只有在吲哚功能化時，T2 clickmer截短體的性能基于測量的平均熒光強度（MFI）優(yōu)于N2.5。通過計算與其打亂非結(jié)合對照相比的熒光倍數(shù)變化，T2顯示增加了16倍，而N2.5顯示了2.3倍的增加。
為了進一步評估T2變體與Omicron刺突蛋白的結(jié)合親和力，我們進行了生物層干涉術(shù)（BLI）分析。將生物素化的T2固定在SA傳感器上，并暴露于三聚體Omicron刺突蛋白的系列稀釋液中。產(chǎn)生的傳感圖得出的解離常數(shù)（KD）為1.3 nM，表明T2與Omicron刺突之間存在高親和力相互作用，這與流式細胞術(shù)中觀察到的增強結(jié)合強度一致。為了評估特異性，T2也針對重組神經(jīng)氨酸酶進行了測試。對神經(jīng)氨酸酶獲得的響應(yīng)明顯低于對Omicron刺突的響應(yīng)，證實了T2對刺突蛋白的選擇性識別。正如預(yù)期，打亂對照T2sc在所有測試蛋白中均表現(xiàn)出可忽略的結(jié)合。
結(jié)論
本研究旨在闡明在兩種不同生理條件下鑒定結(jié)合CoV2-S蛋白的不同clickmer。采用了拆分-合并點擊-SELEX方案，涉及同時使用多種修飾。根據(jù)以往的研究，后續(xù)分析顯示，所得的clickmer在點擊-SELEX過程中使用的實體（即苯并呋喃（BF-dU）或吲哚（In-dU））中表現(xiàn)出點擊特異性結(jié)合CoV2-S的親和力。與密切相關(guān)的官能團（例如苯并噻吩（BT-dU））的相互作用分析顯示了變異潛力，為改變clickmer的特性提供了選項。
這些clickmer在結(jié)合CoV2-S變異株（包括Beta、Delta和Omicron）的特異性方面顯示出差異。這些差異可能歸因于富集過程中使用的個體點擊部分或所應(yīng)用的不同選擇條件。胸苷核苷酸替換研究表明，需要八個（clickmer BF1）或七個（clickmer N2）修飾中的至少五個才能保持與刺突蛋白的相互作用。
我們還證明了clickmer N2的截短產(chǎn)生了變體T2（31 nt）。與原始clickmer（82 nt）相比，該變體對CoV2-S變異株表現(xiàn)出更強的結(jié)合親和力。這一發(fā)現(xiàn)表明，原始clickmer序列的空間位阻，或者與截短版本相比，全長版本中采用具有不同相互作用特性的替代構(gòu)象，可能是觀察到的結(jié)合行為的基礎(chǔ)。
與最近的進展（如MEDUSA平臺，該平臺證明含有化學(xué)修飾核苷酸的多價適配體組裝體可以利用靶標幾何結(jié)構(gòu)和價態(tài)來實現(xiàn)增強的親和力和選擇性）一致，我們的發(fā)現(xiàn)進一步強調(diào)了化學(xué)修飾在微調(diào)結(jié)合特異性和性能方面的潛力。所描述的clickmer代表了用于診斷開發(fā)和潛在治療探索的有希望的候選物。這項工作突出了點擊-SELEX方法的適應(yīng)性，特別是在需要快速響應(yīng)的緊急情況下，并說明了其提供敏感檢測探針以用于即時大流行或病毒爆發(fā)控制的潛力。
