《Cell Death & Disease》：PRMT5 upregulates KCNMB4 expression via histone methylation to promote paclitaxel resistance in advanced nasopharyngeal carcinoma
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本研究針對(duì)晚期鼻咽癌化療耐藥難題，發(fā)現(xiàn)PRMT5通過(guò)催化H3R2me2s表觀遺傳修飾激活KCNMB4轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)紫杉醇耐藥。臨床數(shù)據(jù)分析顯示PRMT5/KCNMB4高表達(dá)與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)靶向PRMT5可有效逆轉(zhuǎn)耐藥表型，為克服鼻咽癌化療耐藥提供了新的治療靶點(diǎn)和策略。
在華南地區(qū)高發(fā)的鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma, NPC）雖然對(duì)放化療敏感，但晚期患者常出現(xiàn)化療耐藥導(dǎo)致治療失敗。紫杉醇（Paclitaxel, PTX）作為標(biāo)準(zhǔn)化療方案的重要組成部分，其耐藥機(jī)制亟待闡明。表觀遺傳調(diào)控異常已成為腫瘤耐藥的重要驅(qū)動(dòng)因素，其中蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（PRMT5）作為關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)控因子，在多種癌癥中被證實(shí)參與耐藥過(guò)程，但其在鼻咽癌化療耐藥中的作用尚不明確。
研究人員通過(guò)表觀遺傳化合物庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)，PRMT5抑制劑能顯著增強(qiáng)紫杉醇對(duì)耐藥鼻咽癌細(xì)胞的殺傷效果。機(jī)制研究表明，PRMT5被招募至KCNMB4基因啟動(dòng)子區(qū)域，催化組蛋白H3第2位精氨酸對(duì)稱(chēng)二甲基化（H3R2me2s），進(jìn)而激活KCNMB4轉(zhuǎn)錄。KCNMB4作為大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BK通道）的調(diào)節(jié)亞基，其過(guò)表達(dá)直接導(dǎo)致紫杉醇耐藥。臨床樣本分析進(jìn)一步證實(shí)，PRMT5和KCNMB4的高表達(dá)與鼻咽癌患者較差的生存預(yù)后顯著相關(guān)。
這項(xiàng)發(fā)表于《Cell Death and Disease》的研究首次揭示了PRMT5-KCNMB4軸在鼻咽癌化療耐藥中的關(guān)鍵作用，為晚期鼻咽癌患者提供了新的治療靶點(diǎn)和聯(lián)合治療策略。
研究采用的主要技術(shù)方法包括：表觀遺傳化合物庫(kù)篩選、細(xì)胞增殖與腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、RNA測(cè)序分析、免疫組織化學(xué)染色以及裸鼠移植瘤模型。臨床樣本來(lái)自194例化療治療的鼻咽癌患者隊(duì)列。
組合表觀遺傳藥物篩選鑒定PRMT5抑制劑為紫杉醇增敏劑
研究人員首先建立紫杉醇耐藥的鼻咽癌細(xì)胞系5-8F R，通過(guò)67種表觀遺傳藥物與紫杉醇聯(lián)合篩選，發(fā)現(xiàn)PRMT5抑制劑EPZ015666和GSK591能顯著增強(qiáng)紫杉醇的細(xì)胞毒性作用。計(jì)算抑制值（I值）顯示PRMT5抑制劑在增敏效果中排名前兩位，表明PRMT5是逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
PRMT5抑制劑恢復(fù)鼻咽癌細(xì)胞化療敏感性
藥理學(xué)抑制PRMT5顯著增強(qiáng)紫杉醇對(duì)耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。集落形成實(shí)驗(yàn)顯示聯(lián)合處理組細(xì)胞增殖能力明顯降低，時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)證實(shí)聯(lián)合處理可持續(xù)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)表明PRMT5抑制劑幾乎完全逆轉(zhuǎn)了耐藥細(xì)胞的干細(xì)胞特性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理顯著增加Sub-G1期細(xì)胞比例和凋亡率，Western blot驗(yàn)證PRMT5抑制劑有效降低H3R2me2s水平而不影響PRMT5總蛋白表達(dá)。
PRMT5賦予鼻咽癌化療耐藥并與患者不良預(yù)后相關(guān)
基因敲低實(shí)驗(yàn)證實(shí)PRMT5下調(diào)可顯著增強(qiáng)5-8F R細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。可誘導(dǎo)敲低系統(tǒng)顯示多西環(huán)素（Doxycycline, Dox）誘導(dǎo)PRMT5敲低后，紫杉醇對(duì)腫瘤球形成的抑制作用明顯增強(qiáng)。相反，PRMT5過(guò)表達(dá)使敏感細(xì)胞獲得耐藥表型。臨床樣本免疫組化分析發(fā)現(xiàn)PRMT5在細(xì)胞核和胞質(zhì)中均有表達(dá)，生存分析顯示PRMT5高表達(dá)患者具有更差的無(wú)進(jìn)展生存期和局部無(wú)復(fù)發(fā)生存期。
PRMT5表觀遺傳調(diào)控KCNMB4表達(dá)
RNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)2059個(gè)基因在耐藥細(xì)胞中上調(diào)，其中132個(gè)受PRMT5調(diào)控。交集分析鑒定出13個(gè)共同基因，選擇KCNMB4進(jìn)行深入研究。qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證KCNMB4在耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，PRMT5敲低或抑制劑處理均降低KCNMB4表達(dá)。染色質(zhì)免疫沉淀證實(shí)PRMT5直接結(jié)合KCNMB4啟動(dòng)子區(qū)域，耐藥細(xì)胞中結(jié)合量顯著增加。H3R2me2s在KCNMB4啟動(dòng)子區(qū)域的富集程度在耐藥細(xì)胞中更高，PRMT5抑制劑處理可降低該富集水平。WDR5抑制劑處理同樣下調(diào)KCNMB4表達(dá)并增強(qiáng)紫杉醇敏感性，表明PRMT5通過(guò)H3R2me2s-WDR5通路激活KCNMB4轉(zhuǎn)錄。
KCNMB4賦予紫杉醇耐藥并與鼻咽癌不良預(yù)后相關(guān)
KCNMB4敲低顯著增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，腫瘤球形成能力明顯降低。相反，KCNMB4過(guò)表達(dá)使敏感細(xì)胞獲得耐藥特性，且能逆轉(zhuǎn)PRMT5敲低帶來(lái)的增敏效果。臨床樣本分析顯示KCNMB4作為膜蛋白主要定位在細(xì)胞膜，高表達(dá)與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。Pearson相關(guān)分析證實(shí)PRMT5與KCNMB4蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。
PRMT5下調(diào)恢復(fù)體內(nèi)鼻咽癌化療敏感性
裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示，單獨(dú)使用多西環(huán)素或紫杉醇可延緩腫瘤生長(zhǎng)，而聯(lián)合治療幾乎完全抑制腫瘤進(jìn)展。免疫組化分析證實(shí)聯(lián)合治療組PRMT5和KCNMB4表達(dá)顯著下調(diào)，Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞減少，cleaved caspase-3表達(dá)增加，表明靶向PRMT5能有效恢復(fù)體內(nèi)紫杉醇敏感性。
本研究首次闡明PRMT5通過(guò)H3R2me2s表觀遺傳機(jī)制上調(diào)KCNMB4表達(dá)，從而驅(qū)動(dòng)鼻咽癌紫杉醇耐藥的全新信號(hào)軸。臨床相關(guān)性分析為這一機(jī)制提供了強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)證據(jù)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了靶向PRMT5的治療價(jià)值。考慮到PRMT5抑制劑已進(jìn)入臨床研究階段，本研究為晚期鼻咽癌患者提供了具有直接臨床轉(zhuǎn)化潛力的聯(lián)合治療策略，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。
