《Cell Death & Disease》：O-GlcNAcylation of XRCC4 controls its stability and confers resistance to DNA double-strand break damage in cancer cells
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本研究聚焦于DNA雙鏈斷裂(DSB)修復關鍵蛋白XRCC4在癌癥中的調控新機制。研究人員發現，O-葡萄糖胺化(O-GlcNAcylation)修飾通過穩定XRCC4蛋白水平，顯著增強癌細胞對DNA損傷的抵抗能力。該研究首次鑒定出XRCC4 Thr308為其主要O-葡萄糖胺化位點，并揭示該修飾通過抑制E3泛素連接酶TRIM21介導的K48多聚泛素化降解途徑，從而增強XRCC4穩定性。這一發現為開發針對DNA損傷修復通路的新型癌癥治療策略提供了重要理論依據。
在癌癥研究領域，DNA損傷修復機制一直是科學家們關注的焦點。眾所周知，基因組不穩定性是驅動腫瘤發生的關鍵因素，但同時也構成了癌細胞的"阿喀琉斯之踵"。化療、放療以及腫瘤微環境中的缺氧和營養缺乏狀態都會導致DNA損傷的累積，特別是最具細胞毒性的DNA雙鏈斷裂(DSB)。為了生存，癌細胞進化出了高效的DNA損傷應答(DDR)機制，其中非同源末端連接(NHEJ)是哺乳動物細胞修復DSB的主要途徑。
在這一修復過程中，X射線修復交叉互補蛋白4(XRCC4)作為NHEJ通路的核心組件，與DNA連接酶IV(LIG4)形成復合物，對斷裂的DNA末端進行連接，在癌細胞化療抵抗和生存中發揮著關鍵作用。有趣的是，先前的研究發現XRCC4在多種癌癥細胞和組織中高表達，而另一種重要的蛋白質修飾——O-葡萄糖胺化(O-GlcNAcylation)水平在癌癥中也異常升高。這種修飾作為營養和應激傳感器，動態調節著多種細胞過程。然而，這兩種現象之間是否存在內在聯系，以及它們如何共同影響癌癥進展，始終是未解之謎。
韓國延世大學的研究團隊在《Cell Death and Disease》上發表的這項研究，首次揭示了O-葡萄糖胺化對XRCC4功能的直接調控機制。研究人員發現，XRCC4在Thr308位點的O-葡萄糖胺化修飾通過抑制TRIM21介導的泛素-蛋白酶體降解途徑，顯著增強了XRCC4的穩定性。這一機制在DNA損傷條件下尤為關鍵，使癌細胞能夠有效修復DSB，從而產生治療抵抗。更重要的是，該修飾還促進了癌細胞的增殖、侵襲和體內腫瘤生長。
為開展這項研究，研究人員運用了多種關鍵技術方法：通過CRISPR-Cas9基因編輯技術構建XRCC4基因敲除細胞系；利用質譜分析鑒定XRCC4的O-葡萄糖胺化位點；采用蛋白質免疫共沉淀和體內泛素化分析研究蛋白質相互作用和修飾；建立異種移植小鼠模型評估腫瘤生長；使用報告基因系統分析NHEJ和同源重組(HR)修復效率；并通過細胞活力、侵襲和軟瓊脂克隆形成實驗評估癌細胞惡性表型。
XRCC4蛋白水平受細胞O-葡萄糖胺化水平調控
研究發現，在結腸癌組織和多種癌細胞系中，XRCC4蛋白和O-葡萄糖胺化水平均顯著升高。通過藥理學和遺傳學手段調控O-葡萄糖胺化水平，研究人員證實了其與XRCC4蛋白表達的正相關關系。值得注意的是，高葡萄糖條件能增強XRCC4表達，而OGT過表達可逆轉低葡萄糖條件下XRCC4的下調。
細胞O-葡萄糖胺化水平通過影響泛素依賴性蛋白酶體降解來調節XRCC4穩定性
機制研究表明，O-葡萄糖胺化并不影響XRCC4的mRNA水平，而是通過調控蛋白質穩定性發揮作用。環己酰亞胺(CHX)追蹤實驗顯示，提高O-葡萄糖胺化水平可延長XRCC4蛋白半衰期。蛋白酶體抑制劑MG132能逆轉OGA過表達引起的XRCC4下調，且降低O-葡萄糖胺化水平會顯著增加XRCC4的K48連鎖多聚泛素化。
TRIM21介導的XRCC4泛素依賴性蛋白酶體降解受細胞O-葡萄糖胺化水平調控
通過互作組分析，研究人員將TRIM21鑒定為XRCC4的E3泛素連接酶。TRIM21敲低可增加XRCC4水平，而其過表達則降低XRCC4水平。重要的是，TRIM21敲低可逆轉OGA過表達引起的XRCC4降解。機制上，O-葡萄糖胺化水平降低增強了XRCC4與TRIM21的相互作用，而不影響TRIM21本身的表達水平。
Thr308是XRCC4的主要O-葡萄糖胺化位點
研究人員通過質譜分析鑒定出XRCC4的四個O-葡萄糖胺化位點：S303、S304、T308和S309。其中，Thr308位點的突變(T308A)對O-葡萄糖胺化水平影響最為顯著，表明其為XRCC4的主要O-葡萄糖胺化位點。該位點在多個物種中高度保守。
Thr308 O-葡萄糖胺化調控XRCC4穩定性
在XRCC4敲除細胞系中穩定表達XRCC4 WT或T308A突變體，發現T308A突變體的O-葡萄糖胺化水平和蛋白表達均降低。雖然mRNA水平無顯著差異，但XRCC4 WT的半衰期明顯長于T308A突變體。同時，T308A突變體的K48多聚泛素化水平更高，且與TRIM21的相互作用更強。
XRCC4 Thr308的O-葡萄糖胺化調控癌細胞對DNA雙鏈斷裂損傷的抵抗
博來霉素誘導的DNA損傷實驗顯示，XRCC4 Thr308的O-葡萄糖胺化在DNA損傷應答中起關鍵作用。XRCC4 WT表達細胞能更有效地修復DSB，表現為γH2AX水平更快下降，而T308A突變體細胞修復效率低，細胞死亡率高。細胞活力實驗進一步證實，XRCC4 Thr308的O-葡萄糖胺化顯著增強癌細胞對博來霉素的抵抗能力。
XRCC4 O-葡萄糖胺化促進癌細胞增殖和腫瘤生長
功能實驗表明，XRCC4 Thr308的O-葡萄糖胺化顯著促進癌細胞增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成。動物實驗進一步證實，表達XRCC4 WT的細胞形成的腫瘤明顯大于T308A突變體組，表明該修飾對體內腫瘤生長至關重要。
本研究系統闡明了O-葡萄糖胺化在調控DNA損傷修復中的新機制。XRCC4 Thr308的O-葡萄糖胺化作為關鍵分子開關，通過抑制TRIM21介導的泛素化降解，穩定XRCC4蛋白水平，從而增強癌細胞對DNA損傷的修復能力和治療抵抗。這一發現不僅深化了對蛋白質翻譯后修飾調控DNA損傷應答機制的理解，更重要的是為癌癥治療提供了新靶點。針對XRCC4 Thr308 O-葡萄糖胺化的特異性干預策略，有望成為增強傳統化療和放療療效的有效手段，為克服腫瘤治療抵抗提供了新的思路。
