《Cell Death & Disease》：ZC3H15 regulates the ubiquitination of PTEN via recruitment of TRIM56 and promotes malignant progression of non-small cell lung cancer
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本研究針對非小細胞肺癌(NSCLC)治療面臨的惡性進展和化療耐藥難題，揭示了ZC3H15通過其DFRP結構域結合PTEN并招募E3連接酶TRIM56，促進PTEN發生K48連接的多聚泛素化降解，從而激活AKT-mTOR信號通路，最終促進NSCLC增殖、遷移、侵襲及順鉑耐藥。這一發現為ZC3H15作為NSCLC治療新靶點提供了理論依據。
肺癌是全球范圍內最常見的癌癥之一，也是癌癥相關死亡的主要原因。其中，非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的85%，其5年生存率僅為約19%。更嚴峻的是，超過一半的NSCLC患者在確診時已出現轉移性疾病，這使得早期診斷和有效治療策略的制定變得至關重要。盡管手術、放療和靶向治療等手段不斷進步，但NSCLC的惡性進展和化療耐藥仍是臨床面臨的巨大挑戰，迫切需要探索新的分子機制和治療靶點。
鋅指CCCH型包含15(ZC3H15)是CCCH鋅指蛋白家族的成員，是一種高度保守的真核蛋白，參與多種與腫瘤發生相關的細胞過程。此前的研究表明，ZC3H15在膠質母細胞瘤和胃癌中高表達，并通過調控EGFR或c-Myc的穩定性促進腫瘤進展。然而，ZC3H15在NSCLC中的作用及其分子機制尚不清楚。
為了回答ZC3H15在NSCLC中的功能和作用機制，研究人員開展了一項系統性的研究。他們整合了GEO和TCGA數據庫的轉錄組數據，通過生物信息學分析篩選出ZC3H15作為NSCLC中關鍵差異表達基因。隨后利用Western blot、免疫組織化學、細胞功能實驗（CCK-8、集落形成、EdU、Transwell等）、動物模型、免疫共沉淀、泛素化實驗、分子對接等技術，深入探究了ZC3H15的表達、功能、分子機制及其臨床意義。
本研究主要關鍵技術方法包括：1. 生物信息學分析：整合GEO和TCGA數據庫篩選差異表達基因并進行生存分析；2. 臨床樣本分析：收集164例NSCLC患者組織樣本進行免疫組化染色和Western blot驗證；3. 細胞功能實驗：通過基因過表達和沉默技術，利用CCK-8、集落形成、EdU、Transwell等方法評估細胞增殖、遷移和侵襲能力；4. 分子機制研究：采用免疫共沉淀、泛素化實驗、分子對接等技術探索蛋白質相互作用和修飾機制；5. 動物實驗：建立裸鼠移植瘤模型驗證體內功能。
ZC3H15在NSCLC進展和預后中起關鍵作用
通過分析五個GEO數據集和TCGA數據庫中的肺腺癌(LUAD)和肺鱗狀細胞癌(LUSC)樣本，研究人員發現了861個在NSCLC樣本中上調的基因。生存分析顯示，ZC3H15在高表達且與不良預后相關。TIMER數據庫分析表明，ZC3H15 mRNA在多種腫瘤組織（包括LUAD和LUSC）中高表達。對1149個TCGA樣本的分析顯示，ZC3H15 mRNA水平在肺癌組織中顯著增加。臨床病例相關因素分析表明，高ZC3H15表達水平與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結轉移相關。
過表達ZC3H15促進NSCLC的惡性進展
免疫熒光實驗顯示，ZC3H15主要定位于肺癌細胞的細胞質中。在NSCLC細胞系（包括A549、NCI-H1299、NCI-H1975和SK-MES-1）中，ZC3H15表達水平高于正常支氣管上皮細胞系HBE。通過CCK-8、集落形成和EdU實驗，研究人員證明過表達ZC3H15促進了體外細胞增殖能力，同時在體內也促進了腫瘤生長。此外，過表達ZC3H15增加了肺癌細胞的遷移和侵襲能力。
ZC3H15通過AKT-mTOR通路促進NSCLC細胞腫瘤發生
GSEA分析提示ZC3H15與AKT-mTOR通路相關。Western blot分析顯示，過表達ZC3H15后p-AKT和p-mTOR蛋白表達水平上調，而ZC3H15基因沉默則產生相反效果。使用AKT通路抑制劑LY294002處理后，ZC3H15過表達引起的AKT-mTOR信號通路激活被抑制，同時細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用也被逆轉。
ZC3H15是一種新型PTEN相互作用蛋白
通過蛋白質譜分析，研究人員篩選出388個結合蛋白，其中16個與BioGRID在線數據庫中可能與ZC3H15相互作用的蛋白有交集。由于PTEN負調控AKT信號通路并影響腫瘤預后，研究人員選擇PTEN作為可能與ZC3H15相互作用的候選蛋白。免疫共沉淀實驗證實了ZC3H15與PTEN的相互作用，免疫熒光染色顯示ZC3H15和PTEN在細胞質中共定位。
ZC3H15通過其DFRP結構域與PTEN結合
ZC3H15包含兩個CCCH鋅指結構域和一個保守的DFRP結構域。研究人員構建了一系列缺失CCCH和DFRP結構域的突變體，免疫共沉淀實驗顯示，缺失ZC3H15中的DFRP結構域消除了ZC3H15與PTEN的相互作用。此外，DFRP結構域的缺失顯著抑制了AKT-mTOR信號通路的激活以及肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。
ZC3H15招募TRIM56促進PTEN泛素化
研究發現ZC3H15不影響PTEN mRNA表達水平，但改變PTEN蛋白表達水平。使用放線菌酮(CHX)阻斷蛋白質合成后，發現敲低ZC3H15延長了內源性PTEN的半衰期。免疫共沉淀實驗表明，上調ZC3H15促進了PTEN泛素化和降解。進一步研究證實，K48連接的泛素鏈（而非K63連接的鏈）介導了PTEN的多聚泛素化。通過分析ZC3H15質譜數據中的E3泛素連接酶，研究人員發現TRIM56排名第一。分子對接技術、免疫共沉淀和免疫熒光實驗表明，ZC3H15、TRIM56和PTEN形成復合物并在細胞質中共定位。敲低TRIM56抑制了PTEN的泛素化和降解，同時減少了由ZC3H15過表達誘導的PTEN泛素化。
過表達ZC3H15提高體外和體內順鉑耐藥性
TCGA數據庫的藥物篩選顯示，高ZC3H15表達水平與順鉑耐藥相關。ZC3H15在A549/DDP（人肺腺癌順鉑耐藥細胞株）中高表達。重要的是，ZC3H15過表達增加了NSCLC細胞對順鉑的耐藥性。研究人員構建了小鼠異種移植瘤模型，發現過表達ZC3H15促進了腫瘤生長和體內順鉑耐藥，這一過程依賴于ZC3H15的DFRP結構域。
研究結論與討論部分強調，本研究首次描述了ZC3H15在NSCLC中的生物學功能和臨床意義。ZC3H15通過招募TRIM56影響PTEN的泛素化，促進NSCLC的惡性進展。因此，ZC3H15可能成為NSCLC有價值的診斷生物標志物，并作為未來NSCLC治療的新靶點。
這項研究不僅拓展了ZC3H15的功能多樣性，也為靶向ZC3H15治療NSCLC提供了分子基礎。盡管AKT-mTOR信號通路是ZC3H15作用的主要通路，但其他通路可能也參與其中。未來探索ZC3H15與其他信號通路（如Kras和TGFβ通路）的交叉對話，將有助于全面了解其在腫瘤發展中的復雜機制。此外，基于ZC3H15/PTEN/TRIM56蛋白復合物的相互作用界面進行小分子藥物的虛擬篩選，有望為開發新的治療策略提供方向。
