《Cell Death & Disease》：Tryptophan metabolic gatekeeping in epithelial repair: GPR35-KLF5 circuitry decodes mucosal damage signals for repair programming
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本研究針對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）中腸黏膜損傷修復(fù)障礙的臨床難題，揭示了G蛋白偶聯(lián)受體35（GPR35）通過獨(dú)特的"三明治"結(jié)構(gòu)（R151-KA-H168）感知色氨酸（Trp）-犬尿氨酸（KYN）-犬尿酸（KA）代謝軸異常，進(jìn)而經(jīng)PI3K-AKT-mTOR通路激活轉(zhuǎn)錄因子KLF5，驅(qū)動(dòng)腸上皮細(xì)胞（IECs）增殖與遷移相關(guān)基因（如EGF、TFF3、TGF-β1/3、MMP1/13）表達(dá)，最終程序化啟動(dòng)腸黏膜修復(fù)。該發(fā)現(xiàn)為UC的黏膜愈合治療提供了新靶點(diǎn)。
潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性腸病，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治性疾病之一。其核心病理特征之一是腸黏膜屏障功能損傷，而腸上皮細(xì)胞（IECs）的增殖與遷移是黏膜修復(fù)的生理基礎(chǔ)。然而，IECs如何感知腸黏膜損傷信號(hào)，并啟動(dòng)修復(fù)程序的分子機(jī)制尚不明確。
為解決這一難題，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第八人民醫(yī)院消化內(nèi)科團(tuán)隊(duì)在《Cell Death and Disease》發(fā)表研究，揭示了色氨酸（Trp）代謝產(chǎn)物犬尿酸（KA）通過G蛋白偶聯(lián)受體35（GPR35）感知損傷信號(hào)，經(jīng)PI3K-AKT-mTOR通路激活轉(zhuǎn)錄因子KLF5，進(jìn)而程序化驅(qū)動(dòng)腸黏膜修復(fù)的分子環(huán)路。該研究首次提出"代謝門控"機(jī)制，為UC的黏膜愈合治療提供了新策略。
關(guān)鍵技術(shù)方法
研究利用臨床UC患者腸黏膜組織樣本（n=10）進(jìn)行RNA測(cè)序（RNA-Seq）和蛋白驗(yàn)證；通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建GPR35和KLF5基因敲除的腸上皮細(xì)胞系（CCD841 CoN和FHC）；采用分子對(duì)接技術(shù)解析GPR35與KA的"三明治"結(jié)合模式（R151-KA-H168）；通過葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型，結(jié)合抑制劑（如KATII抑制劑PF-04859989、KLF5抑制劑ML264）干預(yù)，動(dòng)態(tài)評(píng)估腸黏膜修復(fù)表型；利用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析（EPD數(shù)據(jù)庫(kù)）和通路富集分析（KEGG）篩選下游效應(yīng)分子。
研究結(jié)果
1. KLF5是GPR35介導(dǎo)腸黏膜修復(fù)的關(guān)鍵效應(yīng)器
RNA-Seq分析顯示，UC患者病變腸黏膜中Trp-KYN-KA代謝關(guān)鍵酶（IDO、KYNAT）表達(dá)上調(diào)。KA處理可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞基因重編程，且GPR35敲除后此效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。基因本體（GO）分析表明差異基因富集于細(xì)胞增殖與遷移相關(guān)通路。KA以劑量依賴性方式促進(jìn)IECs增殖與遷移，該效應(yīng)依賴于GPR35。進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析鎖定KLF5為調(diào)控增殖遷移相關(guān)基因（EGF、TFF3等）的核心轉(zhuǎn)錄因子，且在UC患者腸黏膜中KLF5表達(dá)顯著升高。
2. KLF5通過協(xié)調(diào)IECs增殖與遷移執(zhí)行修復(fù)程序
KLF5敲除顯著抑制KA誘導(dǎo)的IECs增殖、遷移及相關(guān)基因表達(dá)。在GPR35敲除細(xì)胞中過表達(dá)KLF5可部分恢復(fù)修復(fù)表型，但KA的劑量依賴性效應(yīng)消失，表明KLF5是GPR35下游直接執(zhí)行修復(fù)程序的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，KLF5抑制劑ML264干預(yù)加重DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎病理?yè)p傷，并延緩修復(fù)過程中體重恢復(fù)、疾病活動(dòng)指數(shù)（DAS）下降及炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）清除。
3. PI3K/AKT級(jí)聯(lián)解碼GPR35信號(hào)至KLF5依賴性修復(fù)指令
KEGG富集分析提示GPR35下游信號(hào)涉及PI3K/AKT與MAPK通路。KA可激活PI3K/AKT和MEK/ERK通路，但僅PI3K/AKT通路特異性調(diào)控KLF5表達(dá)。使用PI3K抑制劑（PF-04691502）、AKT抑制劑（MK-2206）或mTOR抑制劑（Rapamycin）均能阻斷KA對(duì)KLF5表達(dá)及IECs增殖遷移的促進(jìn)作用。PI3K激動(dòng)劑（740Y-P）可模擬KA效應(yīng)，且該效應(yīng)不受GPR35敲除影響，但被KLF5敲除阻斷。
4. GPR35通過耦合Trp代謝流至KLF5輸出驅(qū)動(dòng)IECs修復(fù)
調(diào)控Trp-KYN-KA代謝流發(fā)現(xiàn)，KYN需轉(zhuǎn)化為KA才能激活PI3K/AKT-KLF5軸；抑制KATII（KYN轉(zhuǎn)氨酶）可阻斷該過程，而外源KA可逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。GPR35敲除或關(guān)鍵位點(diǎn)突變（R151A、H168A）使IECs喪失對(duì)Trp代謝異常的感知能力，導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)中斷。分子對(duì)接顯示GPR35通過R151位點(diǎn)陽(yáng)離子-π鍵和H168位點(diǎn)π-π堆疊與KA形成"三明治"結(jié)構(gòu)，確保代謝監(jiān)測(cè)特異性。
5. GPR35介導(dǎo)的異常Trp代謝感知通過KLF5驅(qū)動(dòng)腸黏膜修復(fù)
在DSS結(jié)腸炎模型中，外源KA干預(yù)可通過激活GPR35-PI3K/AKT-KLF5軸加速腸黏膜修復(fù)，表現(xiàn)為組織病理?yè)p傷減輕、黏液屏障恢復(fù)及炎癥消退。抑制GPR35（CID2745687）、KLF5（ML264）或PI3K（PF-04691502）均阻斷KA的修復(fù)促進(jìn)作用，且修復(fù)速率在抑制劑撤除后顯著加快。
結(jié)論與意義
本研究首次闡明GPR35作為Trp代謝"門控"受體，通過"三明治"結(jié)構(gòu)識(shí)別KA，經(jīng)PI3K-AKT-mTOR通路激活KLF5依賴性轉(zhuǎn)錄重編程，驅(qū)動(dòng)IECs增殖與遷移，最終啟動(dòng)腸黏膜修復(fù)程序。該機(jī)制揭示了代謝物-受體互作在黏膜穩(wěn)態(tài)維持中的核心作用，為UC的黏膜愈合治療提供了以GPR35-KLF5電路為靶點(diǎn)的新干預(yù)策略。
