神經(jīng)病理性疼痛（NP）是一種由體感神經(jīng)系統(tǒng)病變引起的慢性疾病，嚴(yán)重?fù)p害生活質(zhì)量。小膠質(zhì)細(xì)胞的代謝重編程和神經(jīng)炎癥是驅(qū)動NP進(jìn)展的關(guān)鍵因素。盡管碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（ChREBP）這一關(guān)鍵代謝調(diào)節(jié)因子已被證實(shí)對NP具有保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。

本研究通過 spared nerve injury (SNI) 手術(shù)建立NP大鼠模型，并使用Von Frey纖維絲評估機(jī)械性痛覺超敏。通過免疫熒光、RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）檢測小膠質(zhì)細(xì)胞中ChREBP的表達(dá)。功能研究涉及ChREBP的敲低和過表達(dá)，以評估其對小膠質(zhì)細(xì)胞極化、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元興奮性、疼痛行為及脂肪酸代謝的影響。機(jī)制探索通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

SNI手術(shù)后，大鼠損傷同側(cè)（ipsilateral）的機(jī)械痛閾顯著降低。ChREBP在SNI后大鼠SDH小膠質(zhì)細(xì)胞以及體外LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞（HAPI細(xì)胞系）中表達(dá)上調(diào)。ChREBP敲低抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎極化，加劇了神經(jīng)炎癥并加重了疼痛。相反，ChREBP過表達(dá)則促進(jìn)了抗炎表型，抑制了神經(jīng)炎癥并緩解了疼痛。ChREBP增強(qiáng)了小膠質(zhì)細(xì)胞的脂肪酸氧化和能量代謝。機(jī)制上，ChREBP結(jié)合到PGC-1α啟動子上的TFBS1位點(diǎn)，激活其轉(zhuǎn)錄。PGC-1α過表達(dá)能夠挽救由ChREBP敲低引起的損害，包括降低的脂肪酸氧化、受抑的抗炎極化、升高的炎癥因子以及增加的神經(jīng)元興奮性。脂肪酸氧化抑制劑Etomoxir可減弱ChREBP的保護(hù)作用。

ChREBP通過轉(zhuǎn)錄激活PGC-1α，增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞脂肪酸氧化和抗炎表型，從而緩解NP，揭示了一條新的代謝-免疫軸，為NP的潛在治療提供了新思路。

神經(jīng)病理性疼痛（NP）是一種復(fù)雜的慢性疾病，其特征包括自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和機(jī)械性痛覺超敏。研究表明，NP的總體患病率為9.2%，嚴(yán)重影響患者的日常生活和工作能力。因此，闡明NP的病理機(jī)制并發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新的治療靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)價(jià)值。

NP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及整個傷害性通路。脊髓背角（SDH）的小膠質(zhì)細(xì)胞在SNI后迅速被激活。在正常生理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于相對靜息的狀態(tài)。當(dāng)免疫穩(wěn)態(tài)被破壞時，它們極化為兩種極端表型：促炎表型和抗炎表型。有趣的是，不同表型的小膠質(zhì)細(xì)胞不僅在形態(tài)、細(xì)胞數(shù)量和基因表達(dá)水平上發(fā)生顯著變化，其代謝模式也截然不同。促炎小膠質(zhì)細(xì)胞依賴有氧糖酵解，而抗炎小膠質(zhì)細(xì)胞則利用脂肪酸氧化（FAO）來促進(jìn)氧化磷酸化（OXPHOS）。研究表明，抗炎小膠質(zhì)細(xì)胞中較高水平的脂肪酸氧化能增強(qiáng)OXPHOS，提供持續(xù)的能量供應(yīng)，抑制炎癥并促進(jìn)組織修復(fù)。因此，增強(qiáng)抗炎小膠質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)效應(yīng)可能有助于改善NP。

碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（ChREBP）主要調(diào)控糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，維持機(jī)體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)ChREBP在神經(jīng)系統(tǒng)中不僅參與神經(jīng)細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)，還在神經(jīng)炎癥和神經(jīng)損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用。在SNI模型中，外周神經(jīng)損傷導(dǎo)致局部神經(jīng)微環(huán)境發(fā)生變化，包括炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子釋放和代謝紊亂。作為對這些病理變化的反應(yīng)，ChREBP的保護(hù)性上調(diào)可減輕炎癥反應(yīng)，從而緩解疼痛并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。鑒于小膠質(zhì)細(xì)胞代謝重編程對NP發(fā)病至關(guān)重要，且ChREBP兼具代謝調(diào)節(jié)和疼痛調(diào)控的雙重角色，探索ChREBP是否通過靶向小膠質(zhì)細(xì)胞代謝在NP發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用具有重要意義。

本研究闡明了ChREBP通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞脂肪酸氧化、增加抗炎小膠質(zhì)細(xì)胞比例、抑制炎癥反應(yīng)和降低脊髓神經(jīng)元興奮性來緩解疼痛的具體機(jī)制。研究確定了過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（PGC-1α）是ChREBP調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞代謝和NP的重要下游效應(yīng)器。本研究闡明了ChREBP通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞代謝在NP中的保護(hù)作用，并凸顯了其作為開發(fā)基于代謝的NP治療新策略的潛力。

所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：LAEC-2022-144），并嚴(yán)格按照國際疼痛研究協(xié)會（IASP）制定的實(shí)驗(yàn)動物使用倫理指南進(jìn)行。使用8-10周齡、體重200-250g的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。

采用SNI方法建立NP大鼠模型。大鼠吸入2%-3%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，1%-1.5%異氟烷維持麻醉。暴露坐骨神經(jīng)及其分支（腓總神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)），緊密結(jié)扎腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)完整。假手術(shù)組僅暴露神經(jīng)，不進(jìn)行結(jié)扎或離斷。

參照Perrine方法進(jìn)行脊髓立體定位注射。麻醉大鼠后，行椎板切除術(shù)充分暴露L4-L6脊髓節(jié)段。將立體定位儀坐標(biāo)重置為零，最終參數(shù)設(shè)置為X=0.5 mm, Y=0.5 mm, Z=0.5 mm。以0.2 μL/min的速率注射腺相關(guān)病毒（AAV）構(gòu)建體或?qū)φ赵噭�，總體積1 μL。使用的AAV包括靶向小膠質(zhì)細(xì)胞干擾ChREBP的病毒（AAV9-F4/80-shChREBP）、編碼ChREBP的病毒（AAV9-F4/80-oeChREBP）和編碼PGC-1α的病毒（AAV9-F4/80-oePGC-1α）。

參照Hou等方法進(jìn)行鞘內(nèi)導(dǎo)管置入術(shù)。將無菌PE-10導(dǎo)管插入硬膜外間隙并輕柔推進(jìn)至腰膨大。通過導(dǎo)管注射2%利多卡因10 μL，出現(xiàn)短暫后肢癱瘓證實(shí)位置正確。脂肪酸氧化抑制劑Etomoxir溶解于DMSO后用0.9% NaCl稀釋，SNI手術(shù)后每天通過導(dǎo)管給予Etomoxir（0.05 mg/kg）或 vehicle（0.9% NaCl），連續(xù)14天。

使用Von Frey纖維絲評估大鼠的機(jī)械性痛覺超敏。將不同剛度的纖維絲垂直施加于同側(cè)后肢足底表面，逐漸增加力度直至纖維絲彎曲，維持2-5秒。記錄縮足、舔足或甩足等反應(yīng)。根據(jù)公式計(jì)算50%縮足閾值（PWT）。行為學(xué)測試采用盲法進(jìn)行。

取L4-L6節(jié)段脊髓組織OCT包埋冰凍切片（25 μm）。根據(jù)Rexed板層分類將背角劃分為I-VI板層。封閉后，與一抗4°C孵育過夜：Iba-1（小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）、GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）、NeuN（神經(jīng)元標(biāo)志物）、ChREBP、PGC-1α、iNOS（促炎標(biāo)志物）、Arg-1（抗炎標(biāo)志物）。室溫避光孵育相應(yīng)熒光二抗1小時。封片后使用共聚焦顯微鏡采集圖像，ImageJ軟件分析平均熒光強(qiáng)度或陽性細(xì)胞數(shù)。

在冰浴人工腦脊液（ACSF）中制備L4-L6脊髓節(jié)段300 μm厚切片。切片在持續(xù)通入95% O₂/5% CO₂的孵育槽中平衡20分鐘。在室溫下使用EPC 10 USB膜片鉗放大器進(jìn)行全細(xì)胞記錄。在鉗制電位-70 mV下記錄自發(fā)興奮性突觸后電流（sEPSCs）。數(shù)據(jù)以10 kHz數(shù)字化，2 kHz濾波，使用PatchMaster和Clampfit 10.3軟件分析。

使用永生化大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系（HAPI）。細(xì)胞在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、5% CO₂的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

使用靶向ChREBP的小干擾RNA（siRNA）以及ChREBP和PGC-1α的過表達(dá)質(zhì)粒。按照產(chǎn)品說明，使用Namipo轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染入HAPI細(xì)胞，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后的HAPI細(xì)胞用100 ng/mL LPS刺激24小時。

收集HAPI細(xì)胞，離心重懸后，加入CD86/APC、CD206/FITC、CD11b/PE抗體，冰上避光孵育15-20分鐘。離心、重懸、過濾后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

使用Seahorse XFe96細(xì)胞能量代謝分析儀測量小膠質(zhì)細(xì)胞的氧消耗速率（OCR）。實(shí)驗(yàn)前一天，用Seahorse XF校準(zhǔn)液水化傳感器探針板，并在37°C無CO₂培養(yǎng)箱中過夜。同時，將HAPI細(xì)胞以每孔10,000個的密度接種于Seahorse XF細(xì)胞培養(yǎng)微孔板中。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，更換為pH 7.4的Seahorse XF培養(yǎng)基（補(bǔ)充10 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸鈉和2 mM谷氨酰胺）。在OCR測量前，細(xì)胞用或不用4 μM Etomoxir預(yù)處理2小時；隨后在基礎(chǔ)條件下以及依次加入寡霉素（1.5 μM）、FCCP（1 μM）和魚藤酮/抗霉素A（0.5 μM）后測量細(xì)胞OCR。使用BCA蛋白測定試劑盒測定每孔蛋白含量，以細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化OCR數(shù)據(jù)。

使用AG RNAex Pro Reagent提取總RNA。使用Evo M-MLV逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混qPCR試劑盒定量基因表達(dá)，采用2^?ΔΔCt方法以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

使用總蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì)，BCA蛋白測定試劑盒定量。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。封閉后，與一抗孵育：ChREBP、PGC-1α、CPT1A、ACADM、NRF1、TFAM、β-actin。隨后與HRP標(biāo)記的二抗孵育，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，Image J軟件分析條帶。

使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，最小相互作用分?jǐn)?shù)閾值設(shè)為0.4。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件，使用度（degree）算法識別和排序核心基因。使用DAVID在線工具對這些核心基因進(jìn)行功能分析，包括Gene Ontology（GO）分類和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析。

使用JASPAR網(wǎng)站預(yù)測ChREBP在PGC-1α啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)。將空載體（EV）和ChREBP過表達(dá)質(zhì)粒與野生型PGC-1α（WT）或突變型PGC-1α（MUT1：位點(diǎn)1突變；MUT2：位點(diǎn)2突變；MUT3：位點(diǎn)1+2突變）熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HAPI細(xì)胞。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒測量PGC-1α的熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的比值計(jì)算相對熒光素酶活性。

使用Simple ChIP酶解染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞用1%甲醛溶液交聯(lián)后加入甘氨酸終止。PBS洗滌后收集細(xì)胞，離心重懸于含DTT、PMSF和蛋白酶抑制劑的溶液中。混合物用微球菌核酸酶處理，EDTA終止反應(yīng)。離心后，重懸于ChIP緩沖液并進(jìn)行超聲破碎。將超聲破碎后的染色質(zhì)與IgG、組蛋白H3（陽性對照）和ChREBP抗體孵育。加入ChIP級Protein G磁珠，經(jīng)過洗滌、洗脫和純化DNA。使用PGC-1α啟動子特異性引物進(jìn)行RT-qPCR分析。采用比較Ct法計(jì)算目標(biāo)片段的富集倍數(shù)，并標(biāo)準(zhǔn)化至Input樣本。

兩組間數(shù)據(jù)比較采用非配對雙尾Student t檢驗(yàn)。三組及以上數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后檢驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中縮足閾值的評估采用非參數(shù)檢驗(yàn)：兩組比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，三組及以上比較用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)定為p < 0.05。所有分析使用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行。

采用SNI方法成功建立NP大鼠模型。SNI手術(shù)后第3天起，大鼠同側(cè)（Ipsi）痛閾顯著降低并持續(xù)至術(shù)后第21天，而對側(cè)（Contra）痛閾無顯著變化。免疫熒光和RT-qPCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SNI大鼠脊髓背角（SDH）ChREBP表達(dá)顯著增加，且變化主要集中在I-III板層。免疫熒光共標(biāo)顯示，ChREBP主要與Iba-1（小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）共定位，與NeuN（神經(jīng)元標(biāo)志物）有少量共定位，與GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）不共定位。SNI大鼠SDH中Iba-1⁺ChREBP⁺細(xì)胞數(shù)量增加，而NeuN⁺ChREBP⁺細(xì)胞數(shù)量無變化。在體外，LPS刺激顯著上調(diào)了HAPI細(xì)胞中ChREBP的mRNA和蛋白水平。這些結(jié)果表明ChREBP在SNI大鼠SDH小膠質(zhì)細(xì)胞和LPS刺激的HAPI細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，提示ChREBP與小膠質(zhì)細(xì)胞中的NP密切相關(guān)。

為闡明ChREBP在小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用，將靶向ChREBP的siRNA轉(zhuǎn)染至LPS刺激的HAPI細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，ChREBP的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，ChREBP敲低導(dǎo)致CD11b⁺CD86⁺/CD11b⁺CD206⁺細(xì)胞比率增加，表明向促炎表型轉(zhuǎn)變。同時，ChREBP敲低后，LPS刺激的HAPI細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平顯著上調(diào)。相反，將ChREBP過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入LPS刺激的HAPI細(xì)胞后，ChREBP mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。流式細(xì)胞術(shù)顯示ChREBP過表達(dá)降低了CD11b⁺CD86⁺/CD11b⁺CD206⁺細(xì)胞比率，表明向抗炎表型轉(zhuǎn)變。此外，ChREBP過表達(dá)下調(diào)了LPS暴露的HAPI細(xì)胞中促炎因子mRNA水平。

為了在體內(nèi)驗(yàn)證小膠質(zhì)細(xì)胞ChREBP在NP中的作用，在SNI手術(shù)前4周將含有F4/80啟動子的AAV9載體（AAV9-F4/80-shChREBP用于敲低，AAV9-F4/80-oeChREBP用于過表達(dá)）立體定向注射到SD大鼠同側(cè)SDH。免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)，注射AAV-shChREBP可特異性降低SNI大鼠SDH小膠質(zhì)細(xì)胞中ChREBP表達(dá)，而注射AAV-ChREBP則顯著增加其表達(dá)。RT-qPCR分析進(jìn)一步驗(yàn)證了ChREBP mRNA水平的變化。為評估小膠質(zhì)細(xì)胞ChREBP調(diào)控對體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響，使用促炎標(biāo)志物iNOS和抗炎標(biāo)志物Arg-1（均與Iba-1共標(biāo)）進(jìn)行免疫熒光染色。在SNI + AAV-shChREBP組，Iba-1⁺iNOS⁺/Iba-1⁺Arg-1⁺細(xì)胞比率顯著增加，表明向促炎表型轉(zhuǎn)變。相反，SNI + AAV-ChREBP組該比率顯著降低，反映向抗炎表型轉(zhuǎn)變。行為學(xué)測試顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞ChREBP敲低導(dǎo)致SNI后第3、7、14和21天同側(cè)機(jī)械痛閾顯著降低，加劇了NP癥狀。相反，小膠質(zhì)細(xì)胞ChREBP過表達(dá)則顯著提高了同側(cè)機(jī)械痛閾，緩解了NP。重要的是，AAV注射組對側(cè)痛閾無顯著變化。

綜上所述，這些體外和體內(nèi)結(jié)果突顯了ChREBP在小膠質(zhì)細(xì)胞表型中的調(diào)節(jié)作用：它促進(jìn)抗炎極化并抑制促炎反應(yīng)，從而緩解SNI誘導(dǎo)的NP。

為闡明ChREBP調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化和功能的機(jī)制，從STRING數(shù)據(jù)庫篩選出前50個ChREBP相關(guān)基因。隨后對這些基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析。GO功能注釋結(jié)果顯示：在生物過程方面，ChREBP相關(guān)基因顯著富集于脂肪酸穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞對胰島素刺激的反應(yīng)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)等條目；在細(xì)胞組分方面，富集于染色質(zhì)、SREBP-SCAP-Insig復(fù)合物和細(xì)胞質(zhì)等條目；在分子功能方面，關(guān)鍵功能條目是RNA聚合酶II序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。KEGG富集分析進(jìn)一步表明這些基因主要與AMPK信號通路、胰島素抵抗、脂肪酸代謝和代謝通路相關(guān)。鑒于這些通路均與脂肪酸代謝密切相關(guān)，結(jié)果表明ChREBP主要參與小膠質(zhì)細(xì)胞的脂肪酸代謝通路。

為評估ChREBP對小膠質(zhì)細(xì)胞脂肪酸代謝的影響，使用Seahorse XF細(xì)胞外通量分析儀測量OCR（線粒體呼吸和能量代謝的關(guān)鍵指標(biāo)）。結(jié)果顯示，ChREBP過表達(dá)顯著促進(jìn)了LPS暴露的HAPI細(xì)胞的脂肪酸氧化速率、基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸和ATP產(chǎn)量。這些發(fā)現(xiàn)表明ChREBP在小膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝中起關(guān)鍵作用。

從STRING數(shù)據(jù)庫檢索的候選基因中，根據(jù)Cytoscape軟件計(jì)算的連通度（connectivity degree）篩選出核心基因。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PPI網(wǎng)絡(luò)中連通度排名前八的核心基因。結(jié)果顯示，ChREBP顯著提高了PPARG、SCD、FASN、PGC-1α、ACACA和PPARA的mRNA水平。SREBF1和HMGCR呈輕微上調(diào)趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。值得注意的是，PGC-1α的表達(dá)增加最為顯著。作為脂肪酸氧化的主要調(diào)節(jié)因子，這種上調(diào)可能有助于ChREBP過表達(dá)細(xì)胞中觀察到的更高脂肪酸氧化速率，進(jìn)一步支持了ChREBP與小膠質(zhì)細(xì)胞脂肪酸代謝之間的聯(lián)系。

免疫熒光分析顯示，在SNI大鼠模型的SDH中，ChREBP和PGC-1α均與Iba-1共定位。此外，體內(nèi)上調(diào)ChREBP促進(jìn)了ChREBP過表達(dá)SNI大鼠同側(cè)SDH中PGC-1α表達(dá)的增加。而且，ChREBP過表達(dá)的SNI大鼠中PGC-1α mRNA水平上調(diào)。觀察到ChREBP過表達(dá)導(dǎo)致HAPI細(xì)胞中PGC-1α蛋白水平顯著升高。然而，當(dāng)將PGC-1α過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入LPS刺激的HAPI細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)PGC-1α過表達(dá)對ChREBP mRNA和蛋白水平影響甚微。根據(jù)這些結(jié)果，認(rèn)為ChREBP很可能作用于PGC-1α的上游。

為了進(jìn)一步確認(rèn)這種調(diào)節(jié)作用是否是直接的，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。使用JASPAR數(shù)據(jù)庫鑒定了ChREBP在PGC-1α啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）。TFBS 1位于142-151 bp之間，TFBS 2位于1054-1063 bp之間。隨后構(gòu)建了PGC-1α突變質(zhì)粒：PGC-1α-MUT1靶向TFBS 1，PGC-1α-MUT2靶向TFBS 2，PGC-1α-MUT3包含TFBS 1和TFBS 2的雙重突變。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，ChREBP顯著增強(qiáng)了PGC-1α的熒光素酶活性，并且TFBS 1被鑒定為ChREBP在PGC-1α啟動子上的主要結(jié)合位點(diǎn)。使用PGC-1α啟動子引物進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)檢測ChIP DNA產(chǎn)物。結(jié)果顯示，ChREBP增加了PGC-1α啟動子片段的擴(kuò)增。這些發(fā)現(xiàn)表明ChREBP通過結(jié)合其啟動子區(qū)域直接調(diào)節(jié)PGC-1α