為了表征循環(huán)單核細胞在腎移植患者中的浸潤及其向巨噬細胞分化的過程，研究整合了46個單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集，包括13個血液來源細胞數(shù)據(jù)集和33個腎臟移植物來源細胞數(shù)據(jù)集。在通過質(zhì)量控制后，成功整合了150,876個轉(zhuǎn)錄組，無顯著批次效應。以無監(jiān)督方式識別出23個不同的細胞簇，對應血液和腎臟中的細胞類型。通過經(jīng)典標記物和差異表達基因進行注釋，鑒定出包括S100A12⁺LYZ⁺CD14⁺單核細胞和C1QA⁺C1QB⁺MS4A4A⁺巨噬細胞在內(nèi)的免疫細胞亞型。與無排斥組相比，排斥組移植物內(nèi)免疫細胞比例增加，其中巨噬細胞比例從1.19%顯著上升至3.95%。全局細胞互作分析顯示，無排斥組主要與CCL5和LGALS9相關，而排斥組則主要與CXCL10和CXCL9相關，這與近期關于CXCL9和CXCL10在實體器官移植排斥中核心作用的泛器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。

為了更深入理解髓系細胞的異質(zhì)性，研究對之前注釋為“單核細胞”、“巨噬細胞”和“cDC”的所有髓系細胞進行了重新整合，獲得了11個不同的細胞簇。其中包括6個單核細胞群體、3個樹突狀細胞群體和2個巨噬細胞亞型：SELENOP⁺STAB1⁺TREM2⁺巨噬細胞和CXCL10⁺ANKRD22⁺巨噬細胞。在排斥病例的移植物中，整體髓系細胞比例增加一倍，其中CXCL10⁺巨噬細胞的富集尤為顯著，其比例增加了五倍，并且僅在接受者來源的細胞中發(fā)現(xiàn)，表明其與移植物排斥直接相關。

比較兩種巨噬細胞群的轉(zhuǎn)錄組譜發(fā)現(xiàn)，CXCL10⁺巨噬細胞過表達112個特征基因，包括WARS、CXCL9、GBP1、GBP2和GBP5等已知與排斥相關的促炎基因。此外，它們特異性表達LILR受體基因。轉(zhuǎn)錄因子分析表明，SELENOP⁺巨噬細胞表達NR1H家族核受體，而CXCL10⁺巨噬細胞則高表達IRF家族轉(zhuǎn)錄因子。與體外分化的M1/M2巨噬細胞比較發(fā)現(xiàn)，CXCL10⁺巨噬細胞的特征基因有71.8%與M1巨噬細胞共享，而SELENOP⁺巨噬細胞僅32.7%的特征基因與M2共享，提示體內(nèi)巨噬細胞亞型不能簡單套用經(jīng)典的M1/M2分類。細胞起源分析證實，CXCL10⁺巨噬細胞100%來源于受體，而SELENOP⁺巨噬細胞則包含約18%的供體來源細胞和82%的受體來源細胞。細胞互作預測分析揭示了CXCL10⁺巨噬細胞通過CD47-SIRP-α、LILR-HLA I類分子以及PECAM1-CD38等信號通路與微環(huán)境相互作用，提示其來源于循環(huán)單核細胞并浸潤移植物。

為了在更大規(guī)模的外部隊列中驗證結果，研究使用反卷積算法估算了移植前和移植后腎移植物中CXCL10⁺巨噬細胞的比例。結果顯示，在移植前活檢組織中未檢測到CXCL10⁺巨噬細胞，而在無明顯異常或萎縮-纖維化的活檢中其比例極低。相反，在抗體介導的排斥、T細胞介導的排斥和混合性排斥的活檢中，CXCL10⁺巨噬細胞比例顯著增加。此外，其浸潤比例與急性排斥的Banff病變評分和排斥活動指數(shù)呈強正相關，且是炎癥相關最顯著的免疫細胞。生存分析表明，移植物中CXCL10⁺巨噬細胞比例超過0.98%是移植物失功的獨立危險因素。

為了闡明CXCL10⁺巨噬細胞的起源，研究構建了髓系細胞的無監(jiān)督偽時間軌跡。所有軌跡均起源于血液來源的經(jīng)典單核細胞，在中間單核細胞水平形成分支，最終分化為樹突狀細胞和巨噬細胞等。其中一條軌跡形成了通過CD83成熟DC并返回經(jīng)典單核細胞的環(huán)路。通過比較不同軌跡分支的基因表達，鑒定出22個與CXCL10⁺巨噬細胞軌跡特異性相關的轉(zhuǎn)錄本，其中FCN1、LY6E、LILRA2、LILRB2、LST1和LILRA6個基因表達譜相似且表達量高。在外部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中驗證發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CN1和LST1在排斥過程中系統(tǒng)性顯著上調(diào)。軌跡表達圖證實了這些轉(zhuǎn)錄本在CXCL10⁺巨噬細胞軌跡中的特異性，并發(fā)現(xiàn)LILRB2、LILRA5和LILRA2在返回經(jīng)典單核細胞的軌跡末端也上調(diào)，提示再循環(huán)單核細胞可能保留了其在移植物中激活的印記。

近期小鼠模型研究表明，同種異體單核細胞可通過CD47-SIRP-α軸被激活。為了在體外模擬這一過程，研究使用抗CD47抗體激活健康志愿者來源的經(jīng)典單核細胞。激活48小時后，細胞表面的LILRB2和LILRA5表達顯著增加，CD16表達也增加一倍，而LILRB1表達則顯著降低。這些結果提示，通過CD47-SIRP-α軸的同種異體識別可特異性誘導LILRB2等分子的表達，并促使經(jīng)典單核細胞向中間單核細胞表型分化。空間轉(zhuǎn)錄組分析顯示，CXCL10⁺巨噬細胞存在于所有腎臟區(qū)室，但與受損的近端腎小管細胞共定位，表明其在介導組織損傷中發(fā)揮作用。

為了探究LILRB2過表達在巨噬細胞中的作用，研究在THP-1細胞系和原代人巨噬細胞中過表達了LILRB2。結果顯示，過表達LILRB2的巨噬細胞能夠結合自身和非自身的HLA I類分子。與僅激活的T細胞共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，過表達LILRB2的巨噬細胞在特定比例下能顯著增強自體T細胞的增殖，表明巨噬細胞表面的LILRB2過表達可產(chǎn)生促進T細胞增殖的信號。

本研究通過整合大量單細胞數(shù)據(jù)，深入揭示了腎移植排斥中髓系細胞，特別是CXCL10⁺巨噬細胞亞群的關鍵作用。該群細胞完全來源于受體單核細胞，在排斥過程中特異性浸潤移植物，并高表達CXCL9、CXCL10等關鍵趨化因子以及GBP1、WARS等排斥相關基因，其浸潤水平與移植物炎癥嚴重程度和失功風險獨立相關。研究明確了其從經(jīng)典單核細胞經(jīng)CD47-SIRP-α軸和LILRB2等分子激活的分化軌跡，并證實LILRB2在介導同種異體識別和促炎反應中的重要作用，挑戰(zhàn)了其僅為抑制性受體的傳統(tǒng)認知。這些發(fā)現(xiàn)為理解移植排斥的髓系免疫機制提供了新視角，并將LILRB2確立為潛在的治療靶點。然而，針對該細胞亞群的靶向治療策略仍需在更貼近人體的模型中進行驗證。