《Advanced Science》：Hepatocyte BPGM Induces RET Lactylation and Macrophage Reprogramming to Promote Tumorigenesis in Hepatocellular Carcinoma
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本文揭示了糖酵解關鍵酶BPGM在肝細胞癌（HCC）中的促癌新機制：BPGM通過促進P300介導的原癌基因RET第549位賴氨酸（K549）乳酸化修飾，競爭性抑制其泛素化降解，從而穩(wěn)定RET蛋白表達，驅(qū)動HCC細胞增殖遷移；同時，BPGM介導的乳酸分泌增加腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞的組蛋白乳酸化水平，誘導其M2極化，共同促進HCC進展。該研究為HCC提供了新的潛在治療靶點。
BPGM在肝細胞癌組織中上調(diào)并與不良預后相關
研究團隊通過生物信息學分析和臨床樣本驗證發(fā)現(xiàn)，雙磷酸甘油酸變位酶（BPGM）在肝細胞癌（HCC）組織中的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于癌旁組織。基于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫的分析表明，BPGM的高表達與HCC患者較低的組織學分級（G3/G4）、更晚的臨床分期（III/IV）以及更短的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）顯著相關。值得注意的是，BPGM在區(qū)分HCC組織與正常肝組織方面的診斷效能（AUC = 0.8517）顯著優(yōu)于甲胎蛋白（AFP）（AUC = 0.6160）。單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)進一步揭示，BPGM的表達上調(diào)主要發(fā)生在腫瘤組織中的惡性肝細胞。
敲除BPGM在體內(nèi)抑制HCC腫瘤生長
為了在體內(nèi)驗證BPGM的功能，研究人員構(gòu)建了肝細胞特異性Bpgm基因敲除（Bpgm-CKO）小鼠模型，并使用二乙基亞硝胺（DEN）誘導HCC發(fā)生。與對照組（Bpgm-CON）小鼠相比，Bpgm-CKO小鼠的肝臟腫瘤負荷顯著減輕，表現(xiàn)為肝臟重量、最大腫瘤直徑和腫瘤數(shù)量均明顯減少。組織學分析顯示，Bpgm-CKO小鼠肝臟的纖維化程度（α-SMA染色和天狼星紅染色評估）和細胞增殖活性（Ki-67染色評估）也顯著降低。這些結(jié)果證實了肝細胞特異性BPGM缺失能夠有效減緩HCC的進展。
BPGM表達顯著增強單核/巨噬細胞在HCC腫瘤微環(huán)境中的浸潤
結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學和單細胞RNA測序技術，研究人員繪制了HCC腫瘤微環(huán)境（TME）的空間細胞圖譜。分析發(fā)現(xiàn)，在Bpgm-CON小鼠的肝細胞周圍40微米區(qū)域內(nèi)，單核/巨噬細胞是比例最高的免疫細胞群體。空間生態(tài)位分析進一步表明，在肝細胞富集的生態(tài)位中，Bpgm-CON小鼠的單核/巨噬細胞比例顯著高于Bpgm-CKO小鼠。這一發(fā)現(xiàn)提示BPGM的表達促進了單核/巨噬細胞在HCC腫瘤微環(huán)境中的招募和聚集。
BPGM在單細胞水平誘導腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）的M2極化
對小鼠HCC組織的scRNA-seq數(shù)據(jù)深入分析顯示，Bpgm-CKO小鼠中惡性肝細胞和巨噬細胞的比例均有所下降。在惡性肝細胞中，Bpgm-CON小鼠的多個促增殖通路效應分子（如Myc、Met、Jun、Ccnd1、Fos、Axin2）表達更高。對巨噬細胞亞群進行重新聚類分析后，研究人員根據(jù)M2型巨噬細胞標志物Mrc1的表達，將巨噬細胞劃分為M2型腫瘤相關巨噬細胞（M2 TAMs）和非M2 TAMs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bpgm-CON小鼠中M2 TAMs的比例以及M2 TAMs中Mrc1的表達水平均顯著高于Bpgm-CKO小鼠。免疫熒光染色結(jié)果也證實，Bpgm-CON小鼠肝組織中CD68+CD206+的M2型巨噬細胞數(shù)量更多。這些結(jié)果表明，BPGM驅(qū)動了惡性肝細胞的活化與M2型TAMs的擴增。
BPGM促進HCC細胞的體外增殖和遷移
在Huh7和PLC/PRF/5兩種HCC細胞系中過表達BPGM，能顯著增強細胞的增殖能力（CCK-8實驗和克隆形成實驗）和遷移能力（劃痕實驗和Transwell實驗）。相反，利用小干擾RNA（siRNA）敲低BPGM的表達，則能有效抑制HCC細胞的這些惡性表型。這些體外實驗直接證明了BPGM對HCC細胞增殖和遷移的促進作用。
BPGM與HCC細胞中乳酸生成和蛋白質(zhì)乳酸化正相關
基因集富集分析（GSEA）顯示，在Bpgm-CON小鼠的惡性肝細胞中，乳酸代謝和乳酸化相關基因集顯著富集。具體而言，乳酸相關基因（Ldha、Pkm、Hif1α）和乳酸化相關基因（Ep300、Aars1、Hk2）的表達水平更高。TCGA數(shù)據(jù)庫分析也表明，BPGM高表達的HCC患者中，乳酸相關信號通路被激活。體外實驗證實，過表達BPGM的PLC/PRF/5細胞內(nèi)乳酸濃度和整體蛋白質(zhì)乳酸化（Pan-Kla）水平均升高。此外，BPGM的表達與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶P300（EP300）的mRNA水平呈正相關。這些數(shù)據(jù)將BPGM與HCC細胞的乳酸生成和蛋白質(zhì)乳酸化修飾緊密聯(lián)系起來。
BPGM調(diào)控HCC細胞中RET-K549的乳酸化和泛素化
為了尋找BPGM介導的乳酸化修飾的下游靶蛋白，研究人員采用了免疫共沉淀聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析技術。在過表達BPGM的HCC細胞中，原癌基因RET被鑒定為一個關鍵的差異乳酸化蛋白。后續(xù)的免疫共沉淀（Co-IP）實驗驗證了BPGM能夠促進RET蛋白的乳酸化修飾，并導致RET蛋白表達水平上調(diào)。Bpgm-CKO小鼠肝組織中的RET蛋白表達也相應降低。生物信息學預測發(fā)現(xiàn)RET蛋白的K523、K549和K965位點同時是潛在的乳酸化和泛素化修飾位點。通過點突變實驗證實，K549位點的突變（K549R）能同時消除RET的乳酸化和泛素化修飾，而K523R和K965R突變則無此效應。使用葡萄糖抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）降低細胞內(nèi)乳酸水平后，RET的乳酸化修飾減少，同時泛素化修飾增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低P300的表達會降低整體蛋白質(zhì)乳酸化水平，并導致RET的泛素化修飾增強。這些結(jié)果揭示了一個新穎的機制：BPGM通過促進P300介導的RET蛋白K549位點的乳酸化修飾，競爭性地抑制了該位點的泛素化修飾，從而減少了RET蛋白的降解，增強了其穩(wěn)定性。
RET介導BPGM誘導的HCC細胞增殖和遷移
功能回復實驗表明，在過表達BPGM的PLC/PRF/5細胞中敲低RET，能夠顯著減弱BPGM對細胞增殖和遷移的促進作用。反之，在敲低BPGM的細胞中過表達RET，則可以恢復細胞的增殖和遷移能力。這證明RET是BPGM發(fā)揮促癌功能的下游關鍵效應分子。
HCC細胞中的BPGM促進巨噬細胞的M2極化
研究人員進一步探討了BPGM對腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞的影響。發(fā)現(xiàn)過表達BPGM的HCC細胞培養(yǎng)上清液中的乳酸濃度顯著升高。用此條件培養(yǎng)基處理由THP-1細胞經(jīng)PMA誘導分化的M0巨噬細胞后，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞內(nèi)組蛋白乳酸化水平升高，M2型巨噬細胞標志物（MRC1、IL10、ARG1、CD163）的mRNA和蛋白（CD206）表達上調(diào)，流式細胞術檢測到的CD68+CD206+M2巨噬細胞比例也增加。生物信息學分析顯示，在TCGA的HCC數(shù)據(jù)中，BPGM表達與M2巨噬細胞浸潤呈正相關。當使用 monocarboxylate transporter (MCT) 特異性抑制劑Alpha-cyano-4-hydroxycinnamate (CHC) 阻斷乳酸轉(zhuǎn)運后，由BPGM過表達細胞上清液誘導的M2極化效應被顯著削弱。這表明BPGM通過分泌乳酸，以MCT依賴的方式促進了腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞向M2表型的極化。
討論與結(jié)論
本研究系統(tǒng)性地闡明了糖酵解酶BPGM在HCC進展中的新型致癌功能。其核心機制是雙重的：在腫瘤細胞內(nèi)部，BPGM通過增加乳酸生成，促進P300介導的RET原癌蛋白K549位點的乳酸化修飾，該修飾競爭性抑制了RET的泛素化降解途徑，從而穩(wěn)定并增加了RET蛋白的表達，進而驅(qū)動HCC細胞的增殖和遷移；在腫瘤微環(huán)境中，BPGM介導的乳酸分泌增加了腫瘤相關巨噬細胞內(nèi)的組蛋白乳酸化水平，誘導其向促進腫瘤的M2表型極化。這兩條通路共同促進了HCC的腫瘤發(fā)生。該研究不僅深化了對HCC代謝 reprogramming 和腫瘤微環(huán)境相互作用的理解，也為將BPGM作為HCC診斷生物標志物和潛在治療靶點提供了堅實的科學依據(jù)。
