脊髓損傷（SCI）是一種破壞性的神經系統疾病，導致嚴重的運動、感覺和自主神經功能障礙。中樞神經系統（CNS）創傷，包括SCI，通常分為原發性和繼發性損傷階段。原發性損傷由機械力對神經組織造成的急性損傷定義，導致很大程度上不可逆的細胞損失。繼發性損傷階段的特點是創傷后延遲的破壞性炎癥，隨著時間的推移導致進一步的組織損傷，并為神經元再生創造不利環境。

細胞外囊泡（EVs）是膜結合的納米顆粒，作為多種生物活性物質的載體，包括蛋白質、非編碼RNA、核酸和脂質，這些物質可隨刺激而變化。EVs已成為CNS中關鍵生理功能的介質，并在神經創傷繼發性損傷階段的進展中通過將生物活性物質轉移到局部CNS內的受體細胞而發揮關鍵作用。除了局部通訊，新出現的證據表明，CNS創傷和神經炎癥誘導EVs釋放到循環中，從而強烈激活肝臟以啟動肝臟急性期反應，導致促炎細胞因子和趨化因子的產生。這些物質反過來激活全身免疫系統并加速CNS損傷的進展。這些研究強調了CNS釋放的EVs可以調節受體肝臟的功能。然而，反向通路，即SCI激活的肝臟來源的EVs是否以及如何通過器官間通訊影響SCI后的神經元再生，在很大程度上仍不清楚。

本研究揭示了一種由EVs介導的新型肝臟-脊髓器官間通訊，該通訊在SCI后主動抑制神經元修復。研究表明，SCI后肝臟來源的EVs通過循環迅速轉運至受損脊髓，并被病變部位的內源性神經干細胞（NSCs）和星形膠質細胞優先攝取。這些EVs抑制NSCs向神經元和少突膠質細胞分化，并促進星形膠質細胞向神經炎癥反應性星形膠質細胞極化。進一步的質譜（MS）蛋白質組學分析和RNA測序發現，SCI迅速誘導核糖體蛋白S3（RPS3）在肝臟來源的EVs（LEVs）中富集，并確定活化的Kupffer細胞（KCs）是RPS3的主要來源。RPS3誘導核因子κB（NF-κB）信號通路的激活，從而介導病變部位NSCs的分化和星形膠質細胞的極化。在體內清除KCs或肝臟中的RPS3可有效減弱NF-κB激活，恢復軸突再生和髓鞘再生，并促進神經功能恢復。這些發現表明，富含RPS3的LEVs在SCI后通過調節CNS再生微環境發揮關鍵作用。

為研究肝臟如何影響SCI后的病變部位，研究人員在損傷后第1天（1 dpi）收集了LEVs。這些收集的LEVs通過透射電子顯微鏡、動態光散射和蛋白質印跡進行鑒定，然后用PKH26熒光染料標記。隨后，將PKH26標記的LEVs通過尾靜脈注射到SCI大鼠體內，并對脊髓NSCs、星形膠質細胞、神經元和少突膠質細胞進行免疫染色。結果顯示，PKH26標記的LEVs主要被NESTIN陽性的NSCs和GFAP陽性的星形膠質細胞攝取。相比之下，在TUJ1陽性的神經元和CNPase陽性的少突膠質細胞中很少發現PKH26標記的EVs，這歸因于它們在病變部位的稀疏存在。

由于內源性NSCs在SCI后的自我神經發生中起關鍵作用，研究人員評估了LEVs對NSCs分化的生物效應。收集SCI后不同時間點的LEVs并與NSCs共培養。免疫染色顯示，來自SCI大鼠的LEVs，特別是損傷后第1天和第3天（1 dpi-LEVs和3 dpi-LEVs）的LEVs，顯著降低了CNPase陽性的少突膠質細胞和TUJ1陽性的神經元的百分比，表明LEVs阻止了NSCs向少突膠質細胞和神經元的分化。

為確定負責介導NSCs分化的LEV蛋白，研究人員收集了SCI患者血漿樣本中的EVs（血漿EVs，PEVs）。蛋白質組學評估顯示，與健康對照組相比，SCI患者來源的PEVs中有76種蛋白上調，26種蛋白下調。京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析顯示，最顯著的富集通路是核糖體通路。基因集富集分析將43個差異表達蛋白映射到核糖體。蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析確定RPS3為排名最高的蛋白。

為了進一步評估PEVs中貨物的改變是否與肝臟相關，研究人員對SCI后第1天和第3天的肝臟進行了RNA測序。在1 dpi時，肝臟中有431個基因上調，將這些結果與SCI患者PEVs中的差異表達蛋白相結合，發現這431個改變基因中有9個蛋白在PEVs中上調。肝臟中改變最顯著的基因是RPS3。在3 dpi時，肝臟中鑒定出120個上調基因，其中4個來自這些改變基因的蛋白在PEVs中富集，尤其是RPS3。基于這些數據，研究人員提出RPS3（小40S核糖體亞基的一個組成部分，主要與起始因子相關以促進核糖體成熟和翻譯起始）可能是LEVs相關生物效應的原因。

為確認SCI是否誘導了LEVs中RPS3表達的上調，研究人員檢測了SCI后LEVs中RPS3的表達。ELISA檢測顯示，SCI后LEVs中RPS3的富集顯著增加，在1 dpi和3 dpi達到峰值。此外，用1 dpi LEVs處理NSCs 24小時后的免疫染色顯示，RPS3陽性細胞的比例顯著上升。這些發現表明SCI促進了RPS3在LEVs中的富集。為了進一步研究這些攜帶RPS3的LEVs是否直接轉運到病變部位，研究人員采用尾靜脈注射對肝細胞有強親和力的腺相關病毒血清型8（AAV8），以在肝臟中靶向過表達FLAG標記的RPS3。蛋白質印跡證實了FLAG-RPS3在PEVs和LEVs中的存在。病變部位的FLAG免疫染色顯示，肝臟來源的FLAG⁺RPS3存在于Nestin⁺NSCs和GFAP⁺星形膠質細胞中，證實了SCI后RPS3從肝臟到脊髓病變部位的直接轉移。

為研究RPS3是否影響NSC分化，研究人員首先通過免疫染色檢測了病變部位RPS3的表達，發現RPS3陽性細胞的比例在SCI后增加，并且在1 dpi和3 dpi時，超過30%的NESTIN陽性NSCs被RPS3標記，表明病變部位內源性NSCs中RPS3的上調。隨后，研究人員用RPS3處理NSCs。由于RPS3被認為是NF-κB的一個功能亞基，它與p65亞基相互作用，顯著增強NF-κB復合物與特定κB位點的DNA結合親和力，從而激活下游基因的轉錄，因此檢測了磷酸化P65（P-P65）及其下游基因（Il-6）的表達。免疫染色顯示，RPS3處理促進了P-P65向細胞核的轉運，并增加了P-P65陽性細胞的百分比，同時伴有Il-6基因表達的上調。與病變部位RPS3的表達一致，SCI后NSCs中P-P65的表達水平顯著增加，在1 dpi達到峰值。為檢測RPS3對NSC分化的生物效應，將NSCs與RPS3共培養，導致CNPase和TUJ1陽性細胞的百分比減少。此外，這些RPS3誘導的效應可被P65核轉運抑制劑（E）-2-氟-4′-甲氧基芪（JSH23）所消除。這些數據表明RPS3通過激活NF-κB信號通路調控NSC分化。

為了進一步確認LEVs中RPS3的富集是否與NSC分化的改變效應相關，研究人員用來自假手術大鼠（sham-LEVs）或1 dpi大鼠（1 dpi-LEVs）的LEVs處理NSCs，并通過免疫染色檢測P-P65的表達。與對照組相比，sham-LEVs未誘導P-P65的核轉運或增加P-P65陽性細胞的百分比。相反，1 dpi-LEVs促進了P-P65的核轉運并增加了P-P65陽性細胞的百分比。PCR分析顯示，IL-6基因表達被1 dpi-LEVs上調，但sham-LEVs無此作用。此外，在存在1 dpi-LEVs的情況下，向NSCs加入JSH23抑制了1 dpi-LEVs誘導的對NSC分化的效應。這些發現表明肝臟來源的RPS3通過激活NF-κB信號通路調控NSC分化。

肝臟巨噬細胞對于介導肝臟免疫和維持肝臟穩態至關重要。因此，研究人員假設活化的肝臟巨噬細胞可能有助于肝臟中RPS3的上調。為證實這一假設，首先檢測了RPS3在肝臟巨噬細胞中的表達。免疫染色顯示，RPS3的表達在CD68⁺的肝臟巨噬細胞中損傷后6小時（hpi）迅速增加，并在1 dpi和3 dpi達到峰值。隨后，研究人員通過靜脈注射氯膦酸鹽清除大鼠的肝臟巨噬細胞。與未處理的SCI大鼠相比，氯膦酸鹽注射顯著降低了LEVs中RPS3的表達。免疫染色顯示，肝臟中巨噬細胞的清除降低了1 dpi和3 dpi時病變部位RPS3和P-P65的表達。為確定肝臟巨噬細胞來源的RPS3是否能在SCI后直接轉移到病變部位，研究人員培養了原代Kupffer細胞（駐留的肝臟巨噬細胞），并用綠色熒光蛋白（GFP）標記的外源性RPS3轉染它們。接著，收集來自過表達GFP-RPS3的KCs的EVs（KEVs^GFP-RPS3），并進行PKH-26標記。熒光顯微鏡顯示GFP-RPS3和PKH-26在一簇EVs中共表達。此外，為確定非EVs分泌因子是否能實現從肝臟到病變部位的器官間遞送，研究人員收集了來自過表達GFP-RPS3的KCs的EV耗竭條件培養基（KCM^GFP-RPS3）。在體外，用PKH26標記的KEVs^GFP-RPS3或KCM^GFP-RPS3處理NSCs 6小時，發現GFP與PKH26在NSCs的細胞質內共定位。相比之下，非EVs的KCM^GFP-RPS3處理僅誘導細胞質內出現GFP-RPS3。隨后，研究人員分別將KEVs^GFP-RPS3和KCM^GFP-RPS3注射到SCI大鼠體內。24小時后，在病變部位的NESTIN陽性NSCs中發現了GFP和PKH-26雙陽性的KEVs^GFP-RPS3。然而，在接受KCM^GFP-RPS3注射的大鼠的病變部位未觀察到GFP標記的RPS3。這些數據表明EV膜在肝臟-脊髓長距離器官間遞送RPS3中起重要作用。

為研究KEVs是否通過NF-κB信號通路抑制NSC分化，研究人員將NSCs與KEVs共培養。由于CNS損傷強烈激活全身免疫系統，導致肝臟中促炎細胞因子上調，研究人員用25 ng/mL腫瘤壞死因子α（TNF-α）或50 ng/mL IL-6預處理KCs，然后收集KEVs。與對照組或未預處理的KEVs相比，來自TNF-α或IL-6刺激的KCs的EVs（TNF-α KEVs或IL-6 KEVs）顯著增加了KCs中RPS3的表達和EVs中RPS3的富集。通過免疫染色檢測P-P65表達顯示，向NSCs加入TNF-α-或IL-6-KEVs顯著增加了P-P65陽性細胞的百分比并促進了P-P65向細胞核的轉運。為了進一步確認這些外源性RPS3是否能在NSCs中與p65相互作用，研究人員用FLAG標記的外源性RPS3轉染KCs。然后，收集來自這些FLAG-RPS3轉染的KCs的EVs（KEVs^FLAG-RPS3）并加入NSCs。免疫染色顯示FLAG陽性的RPS3定位于細胞質內，證實這些KCs來源的FLAG-RPS3被NSCs攝取。隨后，使用P65抗體進行的下拉實驗證明了其在KEVs^FLAG-RPS3處理的NSCs中與FLAG-RPS3的相互作用。此外，對NSC分化的評估顯示，TNF-α-或IL-6- KEVs處理顯著降低了神經元和少突膠質細胞的百分比。加入JSH23顯著抑制了這些TNF-α-或IL-6- KCs誘導的對NSC分化的生物效應，增加了神經元和少突膠質細胞的比例。這些數據表明，促炎細胞因子刺激富集了KEVs中的RPS3，后者通過激活NF-κB信號通路調控NSC分化。

有趣的是，肝臟中RPS3的免疫染色顯示，在假手術組中，RPS3表達主要定位于CD68^?細胞。與CD68⁺細胞在6 hpi時RPS3的快速富集相反，CD68^?細胞中的表達水平在此時間點保持不變。然而，在1 dpi時檢測到這些CD68^?細胞中RPS3表達的延遲增加。此外，清除肝臟巨噬細胞顯著消除了1 dpi時CD68^?細胞中RPS3的上調。這些發現表明肝臟巨噬細胞可能在啟動肝臟中RPS3上調中起關鍵作用。由于肝細胞是肝實質的主要上皮細胞，約占肝臟體積的80%和肝細胞數量的60%，研究人員接下來檢測了RPS3在肝細胞中的表達。正如所料，白蛋白（ALB）的免疫染色顯示，ALB⁺肝細胞中RPS3顯著增加，在1 dpi和3 dpi達到峰值。此外，肝細胞中RPS3的上調被氯膦酸鹽處理顯著消除。為了進一步研究活化的KCs是否能促進肝細胞中RPS3的富集，研究人員用來自TNF-α預處理的KCs的條件培養基（KCM）處理肝細胞，然后收集這些肝細胞來源的EVs（HEVs）。HEVs中RPS3表達的ELISA分析顯示，與單獨使用KCM處理相比，TNF?α?KCM處理增強了HEVs中的RPS3水平。對NSC分化的評估顯示，TNF-α KCM處理的HEVs處理顯著降低了少突膠質細胞和神經元的百分比。這些數據表明，活化的KCs介導的肝細胞中RPS3富集及其隨后包裝到EVs中抑制了NSCs向神經元和少突膠質細胞的分化。

為測試KC來源的RPS3是否在介導NSC分化中起關鍵作用，研究人員通過siRNA敲低了KCs中的RPS3。通過免疫熒光確認了KCs中RPS3敲低的效率。然后，在存在TNF-α的情況下，收集來自這些RPS3缺失的KCs的EVs（TNF-α-KEV^siRPS3）。通過ELISA檢測RPS3表達顯示，TNF-α-KEV^siRPS3中RPS3的富集顯著降低。隨后，檢測了這些TNF-α-KEV^siRPS3對NSCs分化的生物效應。免疫染色顯示，RPS3的敲低顯著消除了TNF-α-KEVs誘導的效應，增加了少突膠質細胞和神經元的百分比。這種效應可通過補充外源性RPS3來挽救。

為了靶向敲低肝臟中的RPS3表達，應用AAV8攜帶短發夾RNA通過尾靜脈注射敲低肝臟中的RPS3。通過ELISA檢測SCI后LEVs和PEVs中RPS3的表達以評估AAV8-shRPS3在肝臟中的效率，顯示注射AAV8-shRPS3顯著降低了1 dpi和3 dpi時LEVs和PEVs中RPS3的富集。此外，免疫染色顯示，肝臟中RPS3的敲低也降低了NESTIN陽性NSCs中RPS3和P-P65的表達。這些數據表明LEVs通過器官間遞送RPS3影響病變部位NF-κB信號通路的激活。此外，研究人員從AAV8-shRPS3注射的大鼠收集1 dpi和3 dpi的LEVs，并用這些LEVs處理NSCs，顯示肝臟中RPS3敲低顯著消除了1 dpi和3 dpi LEVs對介導NSC分化的相關效應，導致少突膠質細胞和神經元百分比的增加。

鑒于LEVs和肝臟來源的RPS3被星形膠質細胞攝取，研究人員首先通過免疫染色檢測這些EVs是否在體外影響星形膠質細胞的激活。結果顯示，TNF-α KEVs和1 dpi-LEVs處理顯著增加了C3的表達，并伴隨A1相關基因表達和促炎細胞因子的上調。此外，在KCs和肝臟中敲低RPS3有效消除了這些TNF-α KEVs和1 dpi LEVs誘導的對星形膠質細胞激活的效應，導致C3陽性百分比、A1相關基因表達和促炎細胞因子的減少。重要的是，通過外源性RPS3補充可逆轉這些效應，證實了它們對RPS3的特異性依賴。這些數據表明LEVs通過RPS3促進星形膠質細胞向A1型反應性星形膠質細胞極化。

接下來，研究人員將PKH-26標記的KEVs^GFP-RPS3注射到SCI大鼠體內，GFAP免疫染色顯示這些標記的KEVs被GFAP陽性星形膠質細胞攝取。隨后，研究人員通過注射AAV8-shRPS3敲低肝臟中的RPS3表達，導致病變部位GFAP陽性星形膠質細胞中C3表達的減少。這表明肝臟來源的RPS3在星形膠質細胞激活中起關鍵作用。

鑒于星形膠質細胞極化在調節SCI后脊髓微環境及其對NSCs分化的影響中的關鍵作用，研究人員研究了LEVs刺激的星形膠質細胞是否會影響NSC命運。收集來自RPS3處理的星形膠質細胞的條件培養基（CM）并加入NSCs。免疫染色顯示，與ACM處理的NSCs相比，加入RPS3處理的ACM顯著降低了少突膠質細胞和神經元的比例。隨后，研究人員用來自KEVs處理的星形膠質細胞、TNF-α KEVs處理的星形膠質細胞和TNF-α-KEV^siRPS3處理的星形膠質細胞的CM處理NSCs。與KEVs處理的ACM相比，TNF-α KEVs處理的ACM強烈抑制了NSC向少突膠質細胞和神經元的分化，而RPS3敲低消除了這種抑制作用。類似地，評估了來自LEVs處理的星形膠質細胞、1 dpi LEVs處理的星形膠質細胞和1dpi LEVs^shRPS3處理的星形膠質細胞的CM。研究發現1 dpi LEVs處理的ACM顯著降低了少突膠質細胞和神經元的分化，這種效應可通過敲低肝臟來源EVs中的RPS3來逆轉。這些發現表明，富含RPS3的LEVs或KEVs促進了一種抑制SCI后NSCs向少突膠質細胞和神經元分化的星形膠質細胞表型。

為研究肝臟中RPS3的敲低是否影響軸突的再生和髓鞘再生，在損傷后第4周進行免疫染色。與SCI大鼠相比，注射AAV8-shRPS3的大鼠顯著增加了GFAP陽性星形膠質細胞瘢痕邊界內的TUJ1陽性神經元軸突區域。此外，注射大鼠中TUJ1和MBP雙陽性髓鞘再生軸突的比例增加，表明靶向敲低肝臟中的RPS3增強了軸突再生和髓鞘再生。與組織學數據一致，AAV8-RPS3處理的小鼠在BBB評分和斜面測試中表現出改善，表明神經功能恢復更好。

為研究RPS3是否與神經功能障礙程度相關，研究人員收集了SCI患者血漿中的EVs，并在入院時（3天內，初始AIS等級）評估神經功能。SCI患者被分為AIS等級A-D。測量PEVs中RPS3濃度顯示，與對照組和AIS C-D患者相比，AIS A和AIS B患者中RPS3表達顯著增加，表明循環RPS3水平與神經損傷嚴重程度相關。為了進一步研究PEVs中初始PRS3水平是否能預測神經恢復，研究人員在SCI后1個月重新評估了神經功能，發現在初始AIS A或AIS B患者中，那些表現出一個或多個AIS等級改善的患者，其PEVs中的RPS3顯著低于未