《Advanced Science》：CRISPLD2 Attenuates Intervertebral Disc Degeneration by Suppressing Oxidative Stress-Induced Ferroptosis through the miR-548I-IL17A Axis
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本文揭示了CRISPLD2通過調控miR-548I-IL17A軸抑制氧化應激誘導的鐵死亡，從而延緩椎間盤退變（IVDD）的新機制。研究發現CRISPLD2缺失會下調miR-548I表達，導致IL17A上調，促進髓核細胞（NPCs）鐵死亡和椎間盤退變。通過單細胞測序、動物模型和分子實驗驗證，該研究為IVDD的治療提供了新的靶點（CRISPLD2-miR-548I-IL17A軸）和潛在策略（如AAV介導的基因治療）。
2.1 單細胞轉錄組分析揭示CRISPLD2與IVDD和鐵死亡的關聯
通過分析單細胞RNA測序數據，研究發現退行性髓核細胞亞群富集了鐵代謝和脂質過氧化相關基因。CRISPLD2敲低會導致氧化還原失衡、脂質過氧化物升高和鐵積累，促進鐵死亡。偽時間軌跡分析顯示CRISPLD2在退變過程中呈動態變化，NPC3（輕度退變）中表達最高，NPC4（重度退變）中降低。GO富集分析顯示NPC3和NPC4中鐵相關術語和脂質代謝通路顯著富集，且鐵死亡通路活性存在亞型特異性差異。CRISPLD2與鐵死亡關鍵基因（如ACSL4、GPX4、FTH1）相關，表明其可能通過調節氧化應激和鐵死亡參與IVDD。
2.2 CRISPLD2在重度退行性髓核細胞中表達下調
人類椎間盤組織分析顯示，CRISPLD2在輕度退變（Pfirrmann III級）組織中表達暫升，在重度退變（IV-V級）中顯著降低，且與患者疼痛評分（VAS）負相關。小鼠模型（LSI和CINS）中，Crispld2缺失導致Acan下調、Mmp3上調，椎間盤結構破壞，證實CRISPLD2表達與IVDD嚴重程度相關。
2.3 高濃度或長期IL-1β暴露降低NPCs中CRISPLD2表達
IL-1β處理人NPCs后，CRISPLD2表達呈時間依賴性（短期升高，長期降低）和劑量依賴性（低濃度升高，高濃度降低）。同時，細胞外基質（ECM）降解標志物（MMP3、ADAMTS5）上調，合成標志物（ACAN、COL2A1）下調，提示CRISPLD2參與炎癥微環境調控。
2.4 Crispld2缺陷促進IVDD和疼痛相關行為
髓核特異性Crispld2敲除（cKO）小鼠椎間盤出現基質紊亂、蛋白聚糖丟失，MRI顯示信號強度降低。Western blot和免疫熒光顯示Crispld2缺失導致Acan、Col2a1下調，Mmp3、Adamts5上調。行為學實驗表明cKO小鼠運動距離、最大速度和壓痛耐受性下降，提示疼痛敏感性增加。
2.5 Crispld2缺陷通過線粒體功能障礙和氧化應激促進鐵死亡
Crispld2缺失的NPCs中谷胱甘肽（GSH）、NADPH水平降低，氧化型谷胱甘肽（GSSG）、丙二醛（MDA）升高，線粒體形態異常（嵴丟失、膜密度增加）。FerroOrange、ROS和MitoSOX染色顯示鐵積累、活性氧和線粒體超氧化物增加，脂質過氧化（BODIPY）增強。鐵死亡相關蛋白（GPX4、FTH1下調，ACSL4上調）進一步證實Crispld2缺失促進鐵死亡。
2.6 CRISPLD2下調激活IL17A通路
RNA測序顯示CRISPLD2敲低后873個基因差異表達，KEGG和GSEA分析富集到IL17信號通路和鐵死亡。實驗驗證CRISPLD2敲低上調IL17A mRNA和蛋白，而過表達CRISPLD2則抑制IL17A，表明CRISPLD2通過轉錄后調控抑制IL17A。
2.7 CRISPLD2通過調控IL17A表達調節鐵死亡
在CRISPLD2敲低的NPCs中，抑制IL17A可逆轉氧化應激指標（GSH/GSSG、NADPH、MDA）異常，降低鐵積累、ROS和脂質過氧化，并改善線粒體形態。脂質組學分析顯示PE（18:0/20:4）和PE（18:0/22:4）在CRISPLD2敲低時升高，IL17A抑制后回調，證實CRISPLD2-IL17A軸調控磷脂過氧化。
2.8 CRISPLD2通過miR-548I靶向調控IL17A
miRNA測序發現CRISPLD2敲低后miR-548I顯著下調。雙熒光素酶報告實驗證實miR-548I直接結合IL17A的3‘-UTR抑制其表達。功能實驗顯示miR-548I模擬物可逆轉CRISPLD2敲低引起的IL17A上調，而抑制劑則抵消CRISPLD2過表達對IL17A的抑制，確立CRISPLD2-miR-548I-IL17A調控軸。
2.9 MiR-548I通過調控IL17A抑制鐵死亡
過表達IL17A可抵消miR-548I模擬物對氧化應激和鐵死亡的保護作用，而敲低IL17A則緩解miR-548I抑制劑加劇的鐵死亡，表明miR-548I通過靶向IL17A調控鐵死亡。
2.10 Crispld2過表達緩解退變表型和疼痛行為，IL17A過表達逆轉此效應
AAV介導的Crispld2過表達可改善小鼠椎間盤結構，降低IL17A、Mmp3和4HNE表達，緩解疼痛行為；而共過表達IL17A則逆轉這些保護作用，證實Crispld2-IL17A軸在IVDD中的關鍵作用。
2.11 Crispld2缺陷通過痛覺過敏和傷害性輸入增強導致椎間盤源性疼痛
Crispld2缺失的NPCs與背根神經節（DRG）神經元共培養時，促進神經元突起生長和分支，疼痛相關神經肽（CGRP、P物質）表達上調。體內實驗顯示cKO小鼠DRG中CGRP和P物質升高，表明Crispld2缺失通過促進神經長入和傷害性信號傳導加劇疼痛。
3 討論
本研究首次揭示CRISPLD2在IVDD中通過miR-548I-IL17A軸抑制鐵死亡的新機制。CRISPLD2在退變早期代償性上調，晚期下調，其缺失導致IL17A介導的氧化應激和鐵死亡，破壞ECM穩態并引發疼痛。靶向該軸（如AAV-CRISPLD2或miR-548I模擬物）可能成為IVDD的潛在治療策略。
4 結論
CRISPLD2通過miR-548I-IL17A軸抑制氧化應激誘導的鐵死亡，維護髓核細胞穩態，延緩IVDD進展，并調控疼痛敏感性，為IVDD的治療提供了新靶點。
5 實驗方法
研究包含人類椎間盤組織采集、髓核細胞分離培養、Western blot、RT-qPCR、免疫熒光、動物模型構建（LSI、CINS）、行為學測試、病毒注射（AAV）、轉錄組/脂質組學分析等實驗，數據以均值±標準差表示，統計學處理采用t檢驗或單因素方差分析。
