《Advanced Science》：Endothelial Cell-Specific Molecule-1 (ESM1): An Endogenous Anticoagulant and Protective Factor in Venous Thrombosis
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本研究揭示了內皮細胞特異性分子-1（ESM1）作為內源性抗凝劑在靜脈血栓栓塞癥（VTE）中的關鍵作用。通過臨床隊列、斑馬魚及小鼠模型，文章證實ESM1通過其硫酸皮膚素（DS）側鏈激活肝素輔因子II（HCII），從而抑制凝血酶活性。血清ESM1水平在VTE患者中顯著升高，且與D-二聚體聯合可提升診斷準確性。該發現為VTE的病理機制提供了新見解，并提示ESM1作為潛在治療靶點與生物標志物的臨床價值。
1 引言
靜脈血栓栓塞癥（VTE）是一種患病率高、死亡率高的心血管疾病，其早期診斷和干預對于降低死亡率至關重要。凝血級聯反應是血液凝固的核心過程，其活性受到內源性抗凝途徑的精密調控。內皮細胞特異性分子-1（ESM1），也稱為內根皮素，是一種主要由內皮細胞分泌的硫酸皮膚素（DS）蛋白聚糖。盡管臨床觀察發現VTE患者血清中ESM1水平顯著升高，但其在凝血調節中的具體作用機制尚不明確。本研究旨在通過整合臨床分析、斑馬魚和小鼠模型以及生化實驗，探討ESM1在體內如何影響血栓形成和凝血過程。
2 結果
2.1 ESM1水平與VTE患者D-二聚體水平呈正相關
本研究共納入160名參與者，包括98名VTE患者和62名健康對照。結果顯示，VTE患者血清ESM1濃度（498.54 ± 229.47 pg/mL）顯著高于健康對照（198.68 ± 89.62 pg/mL）。ESM1診斷VTE的曲線下面積（AUC）為0.899，當其與D-二聚體聯合使用時，診斷準確性進一步提高（AUC = 0.955）。ESM1水平與D-二聚體水平呈正相關，表明其作為VTE生物標志物的潛力。
2.2 ESM1主要在微血管內皮細胞中表達
通過分析人類和小鼠的單細胞RNA測序數據集，發現ESM1在不同物種的微血管內皮細胞中特異性高表達。斑馬魚原位雜交實驗進一步證實，esm1在節間血管（ISVs）和背縱吻合血管（DLAV）等微血管結構中強烈表達。
2.3 Esm1基因敲除突變體的構建
利用CRISPR/Cas9技術成功構建了兩種斑馬魚esm1敲除突變體（esm1ntu28和esm1ntu29）。這兩種突變體均導致閱讀框移位和提前終止密碼子，產生缺乏關鍵糖基化位點的截短蛋白。突變體在發育早期未見明顯異常，但從10天受精后（dpf）開始表現出存活率下降。
2.4 Esm1功能缺失對出芽 angiogenesis無明顯影響但導致凝血級聯改變
與先前研究不同，本研究發現esm1敲除斑馬魚的血管發育，包括ISV的長度、直徑以及內皮細胞遷移和增殖，均未受到顯著影響。然而，全基因組轉錄組分析顯示，esm1缺失顯著富集了補體和凝血級聯通路，提示其可能參與凝血過程的調節。
2.5 Esm1功能缺失導致血流速度減慢和血栓形成
盡管血管形態正常，但esm1敲除突變體的主靜脈（CV）中血流速度顯著降低。O-聯茴香胺染色顯示，突變體心臟區域紅細胞減少，而尾靜脈中紅細胞聚集增加，表型類似于苯肼（PHZ）誘導的血栓模型。向突變體注射esm1mRNA可挽救這些表型。
2.6 Esm1是抗凝所必需且其過表達足以增強抗凝能力
通過測量刺傷后主靜脈的閉塞時間（TTO），發現esm1敲除突變體的TTO顯著短于野生型。向突變體注射esm1mRNA可延長TTO。在野生型斑馬魚中過表達esm1也能劑量依賴性地延長TTO，證明Esm1在體內具有抗凝活性。
2.7 共價連接的DS糖胺聚糖對Esm1的抗凝活性至關重要
將糖基化位點突變的esm1S138AmRNA注入突變體或野生型斑馬魚，均無法改變TTO。然而，直接向主靜脈注射DS可以挽救突變體的TTO表型，并在野生型中劑量依賴性地延長TTO。體外實驗表明，重組人ESM1蛋白在肝素輔因子II（HCII）存在下能抑制凝血酶活性，但其DS鏈被軟骨素酶ABC消化后，該活性消失。在Esm1敲除（Esm1ko/ko）小鼠中，觀察到出血時間、活化部分凝血活酶時間（APTT）和凝血酶原時間（PT）縮短，而注射重組人ESM1蛋白可以挽救這些凝血功能異常。
3 討論
本研究首次揭示了ESM1作為一種新型內源性抗凝劑，通過其DS鏈激活HCII來抑制凝血酶，從而在靜脈血栓形成中發揮保護作用。VTE患者中ESM1水平升高可能是一種代償性反應，以對抗血栓形成。ESM1與D-二聚體聯合使用有望提高VTE的診斷準確性。研究結果不僅深化了對內源性抗凝途徑的理解，也為開發針對ESM1-HCII軸的新型抗血栓策略提供了理論依據。
4 實驗方法
研究獲得了南通大學附屬醫院的倫理批準。臨床樣本來自VTE患者和健康對照。斑馬魚和小鼠模型用于體內功能研究。實驗方法包括ELISA、原位雜交、CRISPR/Cas9基因編輯、血流分析、TTO測定、小鼠尾靜脈出血時間測量以及體外抗凝血酶活性測定等。統計學分析采用Student's t檢驗、單因素方差分析（ANOVA）等方法。
