《Advanced Science》：Connexin 26 Functions as a Direct Transcriptional Regulator During the Cochlea Development
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本文突破性地揭示了Connexin 26（Cx26）在耳蝸發(fā)育中的非經(jīng)典功能：其通過核定位直接結(jié)合基因組DNA啟動子區(qū)，調(diào)控TSPANC8家族基因（如TSPAN5/15/17）的轉(zhuǎn)錄，進而影響ADAM10成熟及P-鈣黏蛋白（P-cadherin）降解，最終調(diào)控柯蒂氏隧道（TC）的結(jié)構(gòu)形成與聽力發(fā)育。研究不僅顛覆了Cx26僅作為間隙連接通道的傳統(tǒng)認知，更為GJB2突變所致先天性耳聾提供了新的治療策略（如T3激素干預(yù)）。
2.1 間隙連接通道功能障礙并非TC結(jié)構(gòu)異常和Cx26缺陷相關(guān)性先天性耳聾的主要機制
研究通過Cx26條件性敲除（cKO）小鼠模型證實，其出生后18天（P18）出現(xiàn)全頻率重度聽力損失，且耳蝸柯蒂氏隧道（TC）結(jié)構(gòu)發(fā)育異常。為驗證間隙連接通道功能是否為主要致病機制，研究者對新生小鼠連續(xù)腹腔注射經(jīng)典間隙連接抑制劑卡賓氧酮（CBX），發(fā)現(xiàn)即使有效抑制Cx26通道功能，TC結(jié)構(gòu)仍正常發(fā)育，且小鼠未出現(xiàn)顯著聽力損失。這表明Cx26缺陷導(dǎo)致的先天性耳聾主要源于其通道功能以外的機制。
2.2 Cx26在體內(nèi)外均聚集于細胞核
通過Western blot檢測小鼠耳蝸亞細胞組分，發(fā)現(xiàn)Cx26蛋白（約25 kDa）存在于核組分中。免疫熒光染色進一步顯示，Cx26在耳蝸支持細胞及多種細胞系（BxPC-3、HEK293T-Cx26、HeLa-Cx26）中均存在核內(nèi)聚集現(xiàn)象。核質(zhì)分離實驗結(jié)合GAPDH（胞質(zhì)標記物）和組蛋白H3（核標記物）驗證了Cx26的核定位。測序結(jié)果排除BxPC-3細胞中GJB2基因突變干擾，證實野生型Cx26具備核定位能力。
2.3 Cx26直接結(jié)合核蛋白與基因組DNA
免疫共沉淀-質(zhì)譜聯(lián)用（IP-MS）篩選出12種與Cx26相互作用的核蛋白，其中8種定位于核內(nèi)，功能涉及RNA剪接、染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄復(fù)制等。染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）顯示，Cx26結(jié)合峰有9.28%位于啟動子-轉(zhuǎn)錄起始點（TSS）區(qū)域，1.52%直接重疊TSS區(qū)域。基序分析預(yù)測出Cx26潛在結(jié)合DNA序列，GO富集分析提示其參與DNA復(fù)制、GTP酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路。
2.4 Cx26作為TSPAN5、TSPAN15和TSPAN17的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子
空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）和RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，Cx26 cKO小鼠耳蝸中TSPANC8家族基因（尤其是TSPAN5、TSPAN15、TSPAN17）mRNA水平顯著下降。體外實驗證實，Cx26敲低可降低這些基因表達，而過表達則增強其啟動子活性。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，Cx26過表達使TSPAN5、TSPAN15、TSPAN17啟動子活性分別提升401.47%、177.54%和64.24%。ChIP-qPCR進一步驗證Cx26直接結(jié)合這些基因的啟動子區(qū)。
2.5 Cx26通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控TSPANC8/ADAM10復(fù)合物調(diào)控柯蒂氏隧道結(jié)構(gòu)發(fā)育
Co-IP實驗證實TSPAN5、TSPAN15、TSPAN17與ADAM10在耳蝸內(nèi)存在相互作用。Cx26缺陷導(dǎo)致成熟ADAM10蛋白水平下降47.01%，前體ADAM10增加34.60%，但總ADAM10無顯著變化。免疫熒光顯示Cx26 cKO小鼠耳蝸中ADAM10表達降低71.71%。抑制ADAM10活性可延遲P-鈣黏蛋白降解，阻礙內(nèi)外柱細胞（IPCs/OPCs）分離，導(dǎo)致TC開放失敗。而T3激素處理可通過提升ADAM10表達，促進P-鈣黏蛋白破壞，挽救Cx26缺陷引起的TC結(jié)構(gòu)異常。
2.6 調(diào)控ADAM10表達可挽救Cx26缺陷導(dǎo)致的TC結(jié)構(gòu)發(fā)育異常與聽力損失
皮下注射T3可顯著提高血清FT3、FT4水平，并增強耳蝸ADAM10轉(zhuǎn)錄。在Cx26 cKO小鼠中，T3處理使成熟ADAM10蛋白恢復(fù)至正常水平，促進P-鈣黏蛋白降解及TC開放。聽覺腦干反應(yīng)（ABR）和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）檢測顯示，T3處理組小鼠聽力閾值顯著改善，耳蝸放大功能接近野生型。組織學(xué)分析證實T3可挽救Cx26缺陷導(dǎo)致的毛細胞損失，尤其在中轉(zhuǎn)區(qū)域外毛細胞存活率提升76.12%。
3 討論
本研究首次揭示Cx26通過核定位直接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的新功能，其機制涉及TSPANC8/ADAM10/P-鈣黏蛋白軸調(diào)控耳蝸TC發(fā)育。Cx26缺陷引起的先天性耳聾主要源于TC結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，而非間隙連接通道功能喪失。T3干預(yù)可通過上調(diào)ADAM10表達部分挽救聽力損失，為GJB2突變耳聾提供了潛在治療策略。研究還提示Cx26核定位可能依賴其N端結(jié)構(gòu)域，且不同截短突變體可能影響其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，這為表型異質(zhì)性提供了分子解釋。
