抗生素耐藥性已成為現代醫學面臨的重大挑戰，多重耐藥（MDR）細菌的興起對公共衛生構成嚴重威脅。革蘭氏陰性菌的固有耐藥機制主要涉及藥物進入受限和主動外排泵作用，而其他機制如靶點改變、酶介導的藥物降解和代謝途徑變化則起次要作用。為克服細菌耐藥性，研究人員開始開發抗生素佐劑，旨在增強抗生素療效并延緩耐藥性發展。本研究基于匯聚分子平臺（CMPs）指導的多靶點定向配體（MTDL）策略，設計了一類末端烷基修飾的二哌嗪苯衍生物。這些雙功能化合物不僅能抑制AcrB-TolC外排泵系統，還能增強細菌膜通透性，在寬濃度范圍內展現出獨特的活性譜。

為填補雙靶點抗生素佐劑研究的空白，本研究提出了基于現有多功能藥物設計（MfDD）的改進策略——匯聚分子平臺（CMPs）。與MfDD通常依賴現有化合物的物理組合不同，CMPs能優化模塊間的互補性，避免簡單疊加導致的“1+1<1”或“1+1=0”效應。CMPs采用穩定連接體設計確保協同效應，實現“1+1>2”的效果。為篩選靶向外排泵的抗生素佐劑CMPs-001，研究以MDR野生型大腸桿菌BW25113及其外排泵敲除突變株BW25113 (ΔacrB)為模型菌株。通過虛擬篩選和體外活性評估，從數萬種化合物中鑒定出先導化合物SDUKJ-4584，該化合物能特異性增強抗生素對野生型菌株的活性，但對ΔacrB突變株無效，表明其具有顯著的外排泵抑制活性。初步構效關系（SAR）分析揭示SDUKJ-4584的活性由三個關鍵藥效團驅動：帶正電荷的哌嗪頭基、哌嗪連接體及其與末端取代基的特異性連接方式、以及末端疏水鏈的長度和取代模式�；�于這些發現，研究團隊保留了核心苯環和哌嗪結構，并通過計算機輔助設計優化取代基，最終確定了CMPs-001的結構。

CMPs-002的選擇則更側重于CMPs-001的疏水腔特征以及抗生素和非抗生素與細菌膜相互作用的共享機制。研究表明，疏水烴鏈及其修飾對于膜透化活性至關重要。例如，多粘菌素分子中的N-�；�脂肪酸鏈和疏水基團插入細菌膜脂質雙層，破壞相鄰脂質A酰基鏈的堆積。類似地，達托霉素衍生物的體外和體內抗菌活性隨鏈長增加（最多10個碳原子）而提高。這些發現強調了脂肪酸鏈在細菌膜相互作用中的關鍵作用。基于此，CMPs-002通過篩選和優化多種脂肪酸鏈而開發，以獲得最佳的膜透化活性。

在小分子藥物設計中，連接體對于連接CMPs-001和CMPs-002等功能模塊至關重要。哌嗪因其環狀結構、高親水性和生物相容性而被視為理想的連接體。當其對位取代被修飾時，該氮原子能抵抗酶降解，并通過氫鍵供體性質增強化合物與靶點的相互作用，從而優化藥物的生物活性和藥代動力學性質。使用哌嗪作為連接體連接CMPs-001和CMPs-002，顯著提高了所得化合物的溶解度和穩定性，為開發具有強大治療潛力的CMPs系列化合物鋪平了道路。

通過測定化合物對MDR野生型大腸桿菌BW25113及其抗生素敏感突變株BW25113 (ΔacrB)的最小抑菌濃度（MIC），評估了化合物的體外抗菌活性。所有化合物對野生型和大腸桿菌突變株均未顯示出抗菌活性，這表明在后續協同實驗中使用的濃度（≤1/4 MIC）不會因其固有的抗菌活性而影響協同結果，為研究抗生素聯合療法奠定了可靠基礎。

通過高濃度初篩初步評估了化合物逆轉細菌耐藥性的能力，隨后采用標準棋盤格試驗評估了化合物與不同濃度抗生素之間的相互作用。所選抗生素包括米諾環素、苯唑西林、利奈唑胺和利福平等。前三者是AcrB外排泵的底物和膜透化劑，而利福平不是。已知的雙靶點抑制劑PAβN被用作陽性對照，以證明雙靶點抑制劑與抗生素聯用的增強效果。

在亞MIC水平，化合物與米諾環素、苯唑西林、利奈唑胺和利福平等多類抗生素對大腸桿菌BW25113表現出協同效應。通過計算部分抑菌濃度指數（FICI）評估相互作用，其中FICI ≤ 0.5表示協同作用，0.5 < FICI ≤ 1表示相加作用。FICI值是評估藥物組合療效的關鍵指標。值得注意的是，最優化合物實現了低至0.015的FICI值，顯示出卓越的協同效力。

本研究分析了五種優化化合物：A4、C3、C5、C15和C20。A4是在引入雙靶點機制和CMPs-002之前確定的最佳外排泵抑制劑。雖然C3和C5活性相似，但C3具有相對較強的抗菌活性和較低的MIC，這與我們開發抗生素佐劑的目標不符�？股�素耐藥性源于其抗菌活性，因為細菌必須發展某些機制來克服它。因此，沒有抗菌活性的化合物不會導致細菌產生耐藥性�；�于此，C5、C15和C20顯示出作為抗生素增強劑的良好前景。

對化合物進行了高濃度初篩，每組三個平行實驗以確保結果準確性。米諾環素（MIN）的MIC確定為4–8 μg·mL^?1，而PAβN將其MIC降低至0.0625-0.125 μg·mL^?1，證實了其增強抗生素療效的作用。相比之下，低濃度（128 μg·mL^?1）的二甲雙胍顯示出最小的抗生素增強活性。在四種化合物中，C5和C20表現出與PAβN相似的外排泵抑制和膜透化作用。當與1/4 MIC的米諾環素聯用時，C5將米諾環素的MIC降低至0.0625 μg·mL^?1，其抗菌活性比單用提高了64倍，FICI值為0.0157。在棋盤格稀釋試驗中，即使在1/64 MIC濃度下，C5仍能將米諾環素的MIC降低16倍，顯示出強大的協同效應。在高濃度篩選過程中觀察到化合物沉淀，這可能干擾肉眼觀察的準確性，因為沉淀可能被誤認為是細菌生長。為避免這種干擾并獲得更可靠的定量數據，引入了OD₆₀₀測量法。該方法基于光散射在群體水平上提供細菌生長的客觀評估，并通過確保檢測低濃度下的殘留存活率來補充肉眼觀察，準確反映整體生長抑制趨勢。結果顯示，肉眼觀察和OD₆₀₀測量得到的倍數變化模式一致，表明倍數變化計算誤差保持在可接受范圍內。

C5和C20在初步評估中均表現出優異的抗生素增敏活性。由于其適中的鏈長和復雜結構，選擇C20與靶點AcrB進行分子對接。該化合物除了與AcrB的原始結合殘基（Asp408、Val411和Ile445）相互作用外，還能完美結合設計的靶氨基酸，如新的關鍵殘基Asp951和Lys955，以及一個意外的殘基Glu917。其修飾的長鏈末端完美契合AcrB的疏水口袋，實現了CMPs的預期應用。需要進一步指出的是，C20僅在高濃度下顯示增敏活性。在較低濃度下，單個或少數分子無法有效插入脂質雙層或外排泵的疏水腔，因為穿透膜需要克服相對較高的能壘。

結果表明，C5的優異性能可歸因于三個關鍵結構決定因素的協同貢獻：i）帶正電荷的哌嗪頭基，ii）哌嗪連接體及其與末端取代基的特異性連接，iii）末端疏水鏈的長度和取代模式。這些結構元素共同調節分子的整體兩親性、膜相互作用幾何形狀和自組裝行為，從而決定該化合物是作為溫和的膜擾動外排泵抑制劑還是非選擇性表面活性劑。

在生理pH條件下，C5的末端哌嗪環部分質子化，提供“軟”正電荷，使其能夠與革蘭氏陰性菌外膜的陰離子成分發生靜電吸引。這種相互作用促進了分子的界面定位，并利于其疏水鏈插入脂質雙層。哌嗪部分的結構修飾完全消除了抗菌增敏活性，表明哌嗪-Asp408鹽橋，以及哌嗪N-H與Asp404之間的氫鍵相互作用，在維持活性中起重要作用。此外，分子對接分析顯示，哌嗪連接體還能與Asp951和Glu947形成鹽橋，這進一步穩定了C5在AcrB外排泵中的結合構象，從而增強抗生素協同效應。

鏈長的調節與活性呈典型的雙相關系。具有9-14個碳原子的短鏈到中鏈（例如C2）在實驗濃度下以“去污劑樣”方式起作用，產生直接的殺菌效果，但也具有顯著的細胞毒性。相反，超過16個碳原子的長鏈由于溶解性低和臨界膠束濃度（CMC）降低而易于聚集或沉淀，從而削弱膜相互作用。C5的15碳原子烷基鏈處于最佳窗口內，使其能夠深入插入脂質雙層，調節膜流動性和曲率應力，促進抗生素滲透而不引起膜破壞或細胞裂解，并有效克服與通透性相關的耐藥屏障。

連接方式對分子構象和相互作用行為也有顯著影響。C5中直接的N-烷基連接保留了疏水鏈的高度靈活性，使其能夠動態嵌入膜中，并通過疏水相互作用與脂質有效相互作用。相比之下，C15中的羰基連接引入了額外的極性和剛性，改變了電荷分布和鏈取向，這阻止了與Asp951/Glu947形成輔助鹽橋，導致膜破壞增強和毒性增加。C20末端的雙鍵增加了鏈的剛性和插入深度，導致僅在高濃度下才顯示出顯著的增敏作用。此外，在中間芳環中引入氮原子略微降低了增敏活性，表明芳環的電子性質也影響膜相互作用模式。

總之，柔性的陽離子哌嗪頭基、具有15個碳原子的中等長度疏水鏈、非極性的N-烷基連接以及未功能化的末端基團共同定義了C5的最佳藥效團構型，其在增強抗生素通透性的同時保持膜完整性并抑制外排功能，從而在不增加宿主毒性的情況下發揮協同抗菌活性。

AcrB是RND型AcrAB-TolC外排系統的核心組件，以同源三聚體形式跨越細菌內膜。在底物轉運周期中，每個原體依次采用三種構象狀態：松散（L）、緊密（T）和開放（O）。這些功能性構象轉變由跨膜質子梯度產生的質子動力驅動，并通過由關鍵殘基（如Asp407、Asp408和Asp951）形成的保守質子中繼網絡傳遞。

為闡明化合物抑制外排泵的機制，我們分別評估了它們對外排泵抑制和膜通透性的影響。我們首先通過基因敲除實驗證實了化合物的AcrB依賴性活性：當大腸桿菌中acrB基因被刪除后，化合物增強抗生素積累的能力顯著降低，表明AcrB是其活性的主要靶點。為進一步驗證這一發現，進行了尼羅紅外排試驗。尼羅紅是一種特征明確的AcrB底物，通過監測其細胞內積累能夠直接定量評估AcrB介導的轉運。結果顯示，在高濃度下，大多數化合物表現出與PAβN相當或更強的尼羅紅外排抑制作用。值得注意的是，C5和C15幾乎完全抑制尼羅紅外排，其效果與ΔacrB組觀察到的效果相當，表明這兩種化合物都能阻斷AcrB的完整轉運周期。為表征先導化合物C5的抑制動力學，使用濃度梯度（128至1 μg·mL^?1）進行了溴化乙錠外排試驗，以未處理細胞和用亞抑制濃度PAβN處理的細胞作為對照。擬合曲線分析顯示，C5對外排活性的抑制具有明顯的濃度依賴性，這與其對AcrB的特異性結合行為一致。此外，選擇已知具有強膜透化活性的化合物C20進行四環素積累試驗。在128 μg·mL^?1濃度下，C20促進了四環素的快速細胞內積累，阻斷其外排，并將細胞內抗生素濃度提高到與PAβN處理組相當的水平，證明了AcrB抑制和增強膜通透性之間的協同效應。

分子動力學模擬進一步揭示了C5的抑制機制。發現C5結合于AcrB跨膜結構域內TM4、TM5和TM10螺旋交界處的一個變構位點，該位點鄰近保守的質子中繼網絡。C5兩個哌嗪環上的氮原子與Asp408、Asp951和Glu947形成鹽橋，從而穩定局部構象并誘導區域動態變化。在上述相互作用中，暴露的哌嗪末端通過與Asp404的持久氫鍵作用以及長烷基鏈介導的疏水相互作用保持穩定結合。這些相互作用共同導致跨膜區域局部壓縮，將AcrB鎖定在L構象，并阻止底物進入深結合口袋（DBP）所需的關鍵L→T轉變。這些結果表明C5是AcrB的典型變構抑制劑。鑒于AcrB的功能高度依賴于質子動力，我們進一步評估了C5對細菌質子梯度的影響。結果顯示，C5和C20均顯著破壞了內膜質子梯度，而C3和C15的影響相對較弱。其中，A4表現出與經典抑制劑PAβN相當的質子梯度耗散作用。

總之，這些發現證明優化后的化合物通過雙重機制抑制AcrB。它們不僅將AcrB鎖定在非活性構象狀態，而且還破壞了為底物轉運提供能量的質子梯度。這種多靶點作用模式有效阻斷了AcrB外排循環，并顯著促進細胞內抗生素積累，證實這些化合物是有效且有前景的抗生素佐劑。

外排泵驗證實驗顯示出高度的可重復性，為深入探索其在雙靶點機制中增強膜通透性的作用奠定了堅實基礎。本研究旨在增強膜通透性的同時，最大限度地減少膜結構損傷，以降低耐藥性發展風險。為闡明潛在的作用模式，進行了與外源性LPS、PE、PG和心磷脂的棋盤格試驗。這些膜成分對抗菌活性影響可忽略不計，表明化合物不依賴于與單個脂質種類的特異性結合，而是通過非特異性調節膜堆積和通透性起作用。為確保嚴謹性和可靠性，我們對細菌的內膜和外膜進行了直接實驗，并輔以蛋白質泄漏測定等反向驗證方法，以及掃描電子顯微鏡（SEM）觀察。

革蘭氏陰性菌的雙膜結構是一道有效屏障，極大地增強了其抗生素耐藥性。我們的化合物增加了內膜和外膜的通透性，促進抗生素滲透并與其外排抑制活性產生協同作用。實驗結果表明，C5和C20顯著增加了細菌外膜通透性，C5和C20處理組的NPN染色相對熒光強度分別是未處理對照組的1.66倍和1.53倍，而C3和C15的作用較弱，這與協同抗菌發現一致。額外實驗證實，C5和C20增強了細菌內膜通透性，C5和C20處理組的PI染色相對熒光強度分別是未處理對照組的1.33倍和1.55倍，可能是通過增加選擇性通透性的機制實現。蛋白質泄漏測定顯示，C5和C20均未引起蛋白質泄漏。這表明細菌膜的整體完整性基本未受影響。此外，SEM觀察一致顯示，處理后的細菌保持了完整的膜形態，沒有明顯的皺縮、孔洞形成或破裂——這些通常與膜破壞相關的特征。這些結果從反向角度提供了有力證據，表明C5和C20的作用不依賴于粗魯的膜破壞，而是通過更精細和可控的機制增強膜通透性。這種“非破壞性膜透化”效應在顯著改善外源分子（包括抗生素）跨膜進入的同時確保了膜的結構完整性，從而進一步支持了雙靶點抗菌策略的有效性。

這種方法增強了抗菌療效，并在預防耐藥性發展方面顯示出潛力。ROS損傷細菌DNA、蛋白質和細胞膜，最終導致細菌死亡。例如，左氧氟沙星和米諾環素在以其MIC處理野生型大腸桿菌BW25113時，顯著增加ROS產生。與未處理對照相比，添加NAC（N-乙酰半胱氨酸）降低了ROS水平并削弱了抗菌效果，突出了ROS在抗菌機制中的關鍵作用。進一步研究表明，C5和C20在1/4 MIC濃度下與抗生素聯用，顯著增加了ROS產生，并增強了抗生素在1/4、1/8、1/16和1/32 MIC濃度下的殺菌活性。值得注意的是，C5在低至1/32 MIC的濃度下，能將1/4 MIC抗生素的ROS生成能力恢復至其MIC水平。生物膜是附著于表面的微生物群落，與抗生素耐藥性密切相關。外排泵直接或間接影響生物膜形成，許多RND轉運蛋白在生物膜發育中起作用。因此，我們評估了C5和C20對抑制生物膜形成和清除成熟生物膜的影響。發現C5和C20能抑制生物膜形成，C5在1/16 MIC濃度下顯示出60%的抑制率。然而，這兩種化合物對清除成熟生物膜均無效，這與我們的實驗結果一致。在高濃度下，C20誘導了部分生物膜脫落，可能歸因于其強透化活性，但其總體效果有限。當與MIC濃度的米諾環素聯用時，C5和C20即使在低至1/32和1/64 MIC的濃度下，也能顯著增強抗生素減少細菌生物膜形成的能力超過80%。

為進一步評估抗生素佐劑在增強抗菌療效方面的潛力，我們分析了化合物和抗生素對細菌生長和存活抑制的協同效應。此外，我們還評估了在模擬體內條件下，化合物在抗生素清除后維持細菌生長抑制的能力。殺菌曲線實驗顯示，單用米諾環素對野生型大腸桿菌BW25113的抑制效果較弱。然而，當與C5或C20聯用時，在24小時內實現了完全的細菌根除，顯示出卓越的殺菌活性。隨后，我們在高接種量條件下進行了生長抑制曲線實驗，以模擬涉及高細菌載量的臨床場景以及抗生素-佐劑組合的抗菌療效。該實驗還旨在評估佐劑能否在高細菌密度下有效抑制耐藥菌的出現。

在上述實驗中，化合物濃度維持在亞最小抑菌濃度（亞MIC），而米諾環素進行濃度梯度稀釋（從1/16 MIC到1/256 MIC），以1/16 MIC米諾環素和未處理組作為對照。結果表明，即使在低至1/256 MIC的米諾環素濃度下，C5、C15和C20仍表現出顯著的抑制活性。生長抑制效應的進一步比較顯示，所有化合物單用表現出的抑制效果與未處理組相似或略強，而單用米諾環素表現出中等抑制效果，但強于單個化合物或未處理組。值得注意的是，當與化合物聯用時，米諾環素始終完全抑制野生型大腸桿菌BW25113的生長，無論細菌載量如何，均顯示出優異的生長抑制能力。

在PAE實驗中，單用米諾環素對野生型大腸桿菌BW25113誘導了4小時PAE。當與C5、C20聯用時，米諾環素的PAE分別延長至5小時（增加100%）、5小時（增加100%）或8小時（增加400%）。PAE的顯著延長對抗生素療效至關重要，因為它降低了給藥頻率，延長了藥物在體內的有效持續時間，并更有效地抑制細菌生長和繁殖。為進一步驗證佐劑-抗生素聯合方案的長期耐藥控制潛力，我們對野生型大腸桿菌BW25113進行了為期30天的連續誘導實驗。在米諾環素單藥治療組中，細菌對米諾環素產生了明顯的獲得性耐藥，而在米諾環素+C5聯合治療組中未觀察到顯著耐藥性。

綜合活性評估顯示，盡管C5和C20均表現出顯著的抗生素增效活性，但C5在極低濃度（1/64 MIC）下仍保持優異的增效效果，而C20在1/16 MIC濃度下活性顯著減弱。值得注意的是，C5表現出卓越的生物膜抑制功效，這不僅拓寬了其有效劑量窗口，還通過減少生物膜形成降低了細菌毒力�；�于這些關鍵優勢，C5被選為進一步評估的先導候選物。

基于計算機的ADMET預測表明，C5表現出良好的類藥性質，其分子結構嚴格遵循利平斯基五規則（Lipinski's Rule of Five）的理化標準。具體而言，其Caco-2通透性和HIA（人體腸道吸收）分類滿足口服藥物腸道吸收的要求，而其血腦屏障穿透概率處于臨界范圍但未達到高風險閾值。此外，C5的低血漿清除率（<5 mL·(min·kg)^?1）表明其具有優異的代謝穩定性，有利于維持其體內有效濃度。鑒于該分子具有可開發的藥物潛力，我們隨后進行了其廣泛的生物活性評估，主要側重于體內安全性評估和藥效學驗證。

我們的研究系統地評估了C5的安全性。在256 μg·mL^?1濃度下，對小鼠或綿羊紅細胞未觀察到溶血作用，表明該化合物不具有顯著的膜破壞特性。在128 μg·mL^?1濃度下，C5在人胚胎腎（HEK293）細胞中未誘導細胞毒性，而C20則表現出明顯的細胞毒性。為進一步評估其體內毒性，我們采用了大蠟螟（Galleria mellonella）幼蟲模型，并監測了小鼠腹腔注射化合物后的體重變化。結果顯示，即使在高劑量2000 mg·kg^?1下，C5對大蠟螟的致死性也極低，所有治療組均表現出高存活率和強大的生存能力，且C5處理的小鼠體重在給藥后沒有減少反而顯著增加。3D熒光全玻片成像（3D-WSI）分析顯示所有器官的組織結構均得以保留：肺泡完整性、有序的心肌纖維排列、正常的脾臟紅髓分布、規則的肝小梁以及結構完好的腎小球和腎小管。特征區域的定量評估顯示，C5處理組和對照組之間無顯著組織病理學差異，表明無明顯器官損傷。C5（200 mg·kg^?1）局部應用于小鼠脫毛的背部皮膚10天后，未引起紅斑或腫脹，隨后的蘇木精-伊紅（H&E）染色顯示皮膚組織結構完整。通過血清生化分析進一步評估了C5的亞慢性毒性。給藥后3天和14天，通過相應生物標志物（如堿性磷酸酶（ALP）、血尿素氮（BUN）和肌酐水平）評估的肝腎功能以及電解質平衡與未處理組相當�？傊�，這些發現表明C5在升高劑量下仍保持良好的安全性特征，支持其進一步用于體內藥理學應用評估。

為研究C5聯合抗生素治療耐藥細菌感染的治療效果，我們建立了大蠟螟幼蟲感染模型和小鼠多器官感染模型。在大蠟螟感染實驗中，聯合治療組（C5 + 抗生素）和PBS對照組在48小時觀察期內保持100%存活率。相比之下，單藥對照組（單用米諾環素或C5）表現出顯著的死亡率，例如部分幼蟲死亡和存活動物普遍出現身體僵硬。值得注意的是，在低劑量米諾環素或C5治療下，幼蟲死亡率顯著增加，存活動物常出現活動能力喪失。100倍稀釋后的勻漿分析顯示，當C5劑量為100 mg·kg^?1時，米諾環素在100–0.1 mg·kg^?1的劑量范圍內表現出有效的體內殺菌活性。然而，當C5劑量降至0.1 mg·kg^?1時，即使在100或0.1 mg·kg^?1的米諾環素劑量下，抗菌活性的增強也顯著減弱。

為驗證C5的作用機制，我們對大蠟螟幼蟲進行了H&E染色。結果顯示，在大腸桿菌感染組和米諾環素單藥治療組（100 mg·kg^?1）中均觀察到顯著的黑色素沉積，而C5-抗生素聯合治療組的組織形態與PBS對照組非常相似。這一發現有力地證明C5作為抗生素佐劑，通過抑制宿主過度免疫反應發揮協同治療作用。

我們首先進行了藥代動力學（PK）研究以指導后續體內實驗的劑量選擇。結果顯示，該化合物靜脈給藥后表現出約11小時的中等半衰期，不同劑量下的全身暴露量相當，生物利用度中等（約32%）。這些發現表明血漿攝取在測試劑量間相對一致。

基于以上結果，我們隨后在小鼠模型中進行了體內實驗，其中C5的最大劑量設定為20 mg·kg^?1。米諾環素的劑量根據現有信息估算，其體外最小抑菌濃度（MIC）范圍為4–8 μg·mL^?1。因此，我們選擇1–2 μg·mL^?1的體外參考濃度進行體內外推，對應約10 mg·kg^?1的體內劑量。

此外，為進一步驗證C5對抗系統性感染的